一站式IP打造|原来它才是CoIP成功率高的原因
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发布时间：2024-09-30 07:33
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时间：2024-10-14 06:40
免疫共沉淀（CoIP）是以抗原-抗体特异性结合为基础，用于研究蛋白与蛋白之间相互作用的经典方法。 利用免疫共沉淀可以检测两个已知蛋白之间的相互作用，或者利用已知蛋白寻找与之相互作用的未知蛋白。CoIP 是IP的延伸应用，其实验的关键之一是对照组的设置，可以防止我们得到的互作信息是假阳性结果。
三种CoIP对照设置方案
IP/CoIP实验失败需借助对照分析原因，成功也需对照的佐证，以下三种对照方案可作为参考。
其中，我们比较推荐方案一，其成功的概率也较高。
方案一中使用的标签抗体是开展基因蛋白表达、信号转导和基因功能研究的常用工具。
标签抗体的两个主要优势
① 广泛适用：大部分蛋白都没有好用的IP级别抗体（甚至没有WB级别的抗体），但只要将蛋白与标签融合表达，就可以让标签分分钟化身为蛋白的“代言人”，这对于小众物种的研究非常友好，在植物研究中有广泛应用。此外，不同的目的蛋白可以融合相同的标签蛋白，因此实验室只需准备一种标签蛋白的抗体即可检测多个目的蛋白，节省实验经费;
② 特异性好：相对于目的蛋白抗体，用标签抗体做IP效果更好，因为标签抗体非常成熟，亲和力高，特异性好，性能稳定。
随着技术的不断发展，相继开发出具有各种不同功能的蛋白标签，其中常见的蛋白标签有His、Flag、GST、HA、Myc、GFP、MBP 等。
常见问题1.选择标签及标签抗体的考量
动物细胞中的CoIP常用的标签有HA、Flag、GFP和MYC等，而His和GST常用于原核细胞蛋白纯化，哺乳动物细胞中因非分泌蛋白自身存在高组氨酸背景，所以较少使用His标签。
IP的标签抗体务必选择厂家推荐IP应用的抗体噢~为保证IP应用真实可信，可以查看官网是否po出了IP验证的实验结果图片。
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常见问题2.为何A可以拉到B，而B不能拉到A？
如果A能拉到B，说明A和B存在互作，而B不能拉到A，此时应先确认B抗体是否能把B蛋白IP下来；
若不能，则表明B抗体不能做IP，可以考虑换一个抗体或者在蛋白上加标签，使用标签抗体IP B蛋白；
若能，则可能是B 抗体与B结合时占据了B与A结合的位点，导致B 不能再与A结合，此时可以考虑换一个抗体或者在蛋白上加标签，使用标签抗体进行IP。
常见问题3.融合标签对目的蛋白的影响
任何一个标签处于氨基酸序列的某一位置，都有可能影响目的蛋白的表达或功能，如干扰蛋白的正确折叠，致使目的蛋白失活或形成包涵体，或中断亚细胞定位信号，即蛋白能正确翻译和折叠，但在细胞内所处的位置是错误的。通常来说，小分子的肽类标签对目的蛋白的影响较小。
常见问题4.标签蛋白标记位置选择
标签蛋白不管是用于WB，IP或者是蛋白纯化，构建标签时都需要考虑添加在N端还是C端。
这需要根据蛋白结构、定位等特性决定。
标签不能靠近蛋白功能结构域，以最大限度地减少对蛋白自然活性的干扰；
许多蛋白具有N端定位信号，若将标签蛋白构建在N端可能干扰信号序列的功能，最终导致错误定位；或者定位信号序列在翻译后阶段被切除了，标签也随之丢失。还有N端有信号肽/前体肽/有甲硫氨酸切除（如组蛋白H3）的蛋白，后期会切除这些肽段，此类蛋白一般建议将标签构建在C端。
可以在UniProtKB数据库左侧工具栏“PTM/Processing”查询自己构建的蛋白是否包含信号肽/前体肽/切除甲硫氨酸。若没有确切的蛋白结构，或蛋白功能域图谱，建议N端标记和C端标记都构建表达克隆，以检测哪个更有效。
常见问题5.多倍tag的IP效果
理论上，3*Flag应当更容易结合anti-Flag，但还得看整个蛋白的构象! 大多数情况下Flag标签会构建到蛋白的N端/C端，而且大多数情况下蛋白的N端/C端是游离在蛋白表面的，在这种情况下Flag和3*Flag没什么区别。因为抗体结合表位长度一般为4-7个氨基酸，加上抗体本身非常巨大，抗体产生的空间位阻容不下第二个抗体结合在同一个3xFlag上。
当蛋白末端被折叠到蛋白内部，或者被其他结合蛋白所遮蔽时，更长的Flag有利于抗体结合表位的暴露，从而被抗体所结合。
常见问题6.载体为何有双标签？
相比于单标签，双标签可提高蛋白纯度和溶解性。
构建含有目的基因的载体时，使目的基因与2个不同的表位标签融合表达，如Flag、HA、His等。若采用Flag-HA双标签载体，载体转染细胞并表达融合蛋白“Flag-HA-诱饵蛋白”，细胞裂解提取总蛋白，经anti-flag树脂和anti-HA树脂的两步纯化和洗脱，更大限度去除了非特异性蛋白。
组氨酸标签蛋白表达量低，或纯化过程中蛋白不稳定可能是由于目的蛋白疏水性强导致溶解性不高、或未能正确折叠形成包涵体影响纯化效果。大分子增溶性蛋白标签，如 GST、MBP 标签可改善该问题，因此大分子标签与小分子标签组合的双标签蛋白可以提高目的蛋白溶解性和稳定性。
