质粒提取(一)

发布网友发布时间：2024-10-12 21:23

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热心网友时间：2024-10-22 03:59

质粒提取（一）

细菌质粒作为双链闭环DNA，其大小范围广泛，存在于细胞质中，独立于染色体之外，具有自主复制特性。在特定条件下，质粒可能整合到宿主染色体上，通过细胞*传递。质粒已成为基因克隆中最常用的载体分子，纯化大量质粒DNA至关重要。碱裂解法是常用的质粒DNA提取方法，其原理在于利用NaOH和SDS溶液裂解细菌，蛋白质与DNA变性，加入中和液后，质粒DNA复性，蛋白质与染色体DNA不变性，通过离心分离。纯化质粒DNA通常利用其相对较小和共价闭环的性质，如通过氯化铯-溴化乙锭梯度离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，这些方法成本较高或耗时较长。对于小量制备，苯酚、氯仿抽提、RNA酶消化和乙醇沉淀等步骤即可去除残余蛋白质和RNA，满足细菌转化、DN*段分离、酶切、常规亚克隆及探针标记等需求。

质粒DNA提取方法主要包括细菌培养、收获和裂解。细菌培养通常在含有抗生素的液体培养基中生长至对数晚期，以大量提纯质粒。长载体如pBR322需在部分生长的细菌培养物中加入氯霉素以促进扩增，氯霉素抑制宿主蛋白质合成，阻止染色体复制，但松弛型质粒仍可复制，导致质粒拷贝数持续增加。裂解方法需考虑质粒大小、细菌株和后续纯化技术，采用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱处理，或加热处理。大质粒采用溶菌酶、EDTA和SDS处理，破坏细胞壁和细胞外膜，释放质粒。小质粒则可采用EDTA处理后，加入溶菌酶、加热或碱处理，破坏碱基配对，使闭环质粒DNA链复性。特定细菌株如HB101和TG1裂解后易产生糖类，影响纯化，因此不宜采用煮沸法。从表达内切核酸酶A的大肠杆菌菌株中提取质粒时，建议不使用煮沸法，以防质粒DNA降解。

试剂准备包括溶液I、II、III、TE、苯酚/氯仿/异戊醇、无水乙醇、5×TBE、溴化乙锭、RNase A、6×Loading buffer和1%琼脂糖凝胶等。操作步骤包括细菌培养、收获、重悬、裂解、中和、乙醇沉淀、乙醇洗涤和RNA降解等环节，确保高质量的质粒DNA提取。