同一模版DNA在进行PCR扩增时是不是需要不同的两种引物？为什么资料上说引物只要Tm值相似就行？

发布网友发布时间：2022-04-30 02:50

共3个回答

热心网友时间：2023-10-09 00:48

PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。因为在同一PCR反应中，是用一个退火温度的，为了保证目的片段两端的引物都能与模板配对互搭，所以在设计引物时，尽量使两个引物的Tm值不要差别太大！另外，附上引物的设计的基本原则：
一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。而且四种碱基的分布最好随机。同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。
引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。但3′端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则：
① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
② 产物不能形成二级结构。
③ 引物长度一般在15~30碱基之间。
④ G+C含量在40%~60%之间。
⑤ 碱基要随机分布。
⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补。
⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补。
⑧ 引物5′端可以修饰。
⑨ 引物3′端不可修饰。
⑩ 引物3′端要避开密码子的第3位。

热心网友时间：2023-10-09 00:49

那是一对引物，通常所说的正向，反向。他们的碱基不一样，当然Tm值也就不一样了。所以设计引物时尽量设计一术的Tm值，有利于选择最佳的退火温度。

热心网友时间：2023-10-09 00:49

正向引物和反向引物。。。