急求助！！！土壤蔗糖酶活性采用3，5二硝基水杨酸比色法测定的详细步骤！！！
发布网友
发布时间：2022-05-06 10:18
共1个回答
热心网友
时间：2023-10-09 03:42
1. 方法选择及原理
蔗糖酶能酶促蔗糖水解生成葡萄糖和果糖。蔗糖酶活性的测定方法有用酶学的方法测量所产生的葡萄糖（滴定法或重量法）或是根据蔗糖的非还原性，用生成物（葡萄糖和果糖）能够还原菲林溶液中的铜，再根据生成的氧化亚铜的量求出糖的含量。也可根据蔗糖水解的生成物与某种物质（3，5-二硝基水杨酸或磷酸铜）生成有色化合物进行比色测定。还有一种方法，根据蔗糖液酶促反应前后光偏振面的变化（旋光法）进行测定。
目前，我国常用的主要是硫代硫酸钠滴定法，它是测定土壤蔗糖酶活性的经典方法。3，5-二硝基水杨酸比色法重现性较好，且手续较简便，适于成批样品测定。
测定土壤蔗糖酶活性时，均以蔗糖为基质，蔗糖液浓度范围为5-20％。在酸性介质中，蔗糖酶活性最大。为保持该酶最适pH，多使用下列缓冲液：醋酸盐缓冲液（pH4.5-5.5），磷酸盐缓冲液（pH4.9-5.5），醋酸盐-磷酸盐缓冲液（pH5.5）。 2. 试剂配制
（1）3，5-二硝基水杨酸溶液：称0.5g二硝基水杨酸，溶于20ml 2N氢氧化钠和50ml水中，再加18.2g酒石酸钾钠，用水稀释至100ml（不超过7天）。
（2）pH5.5磷酸缓冲液：1/15M磷酸氢二钠（11.867g Na2PO4•2H2O溶于1L蒸馏水中）0.5ml加1/15M 磷酸二氢钾（9.078KH2PO4溶于1L蒸馏水中）9.5ml即成。 （3）8％蔗糖溶液。 （4）甲苯。
（5）标准葡萄糖溶液：将葡萄糖先在50-58℃条件下，真空干燥至恒重。然后取500mg溶于100ml 12mmol苯甲酸溶液中（5mg还原糖/ml），即成标准葡萄糖溶液。
标准曲线绘制：取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7ml含5mg还原糖/ml的标准葡萄糖溶液到50ml容量瓶中，与测定蔗糖酶活性同样的方法进行显色。 3. 试验步骤
称取2.***g新鲜土，置于50ml三角瓶中，注入15ml 8％蔗糖溶液，5ml pH5.5磷酸缓冲液和0.25ml甲苯。摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。到时取出，迅速过滤。从中吸取滤液1ml，注入50ml容量量瓶中，加3ml 3，5-二硝基水杨酸，并在沸水的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。
溶液因生成3-氨基-5-硝基水杨酸而呈橙*，最后用蒸馏水稀释至50ml，并在分光光度计上于波长508nm处进行比色。
为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的误差，每一土样需做无基质（无蔗糖）对照，整个试验需做无土壤对照。 4. 结果计算
蔗糖酶活性以24h后1g土壤葡萄糖的毫克数表示。 葡萄糖（毫克）＝a×50×ts/m a－显色液中葡萄糖浓度（mg/ml）， 50－显色液体积（ml）；
ts－分取倍数（吸1ml滤液比色就是20/1）； m－烘干土质量（g）。
