带gfp标签的蛋白能不能用来做ip

发布网友 发布时间：2022-05-06 04:05

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热心网友 时间：2022-06-28 16:35

EGP绿荧光蛋白(GreenFluorescentPortein，GFP)它的27kDa的单体由238个氨基酸构成，本身就是一个生物发光系统，附带有激发后能发射生物荧光的发光色基，其发光过程不同于其它生物发光组织，是不需荧光素酶参与的。光激发GFP荧光是一个特异性的独立过程，并不需要任何的协同因子、底物或其它来自于水母的基因表达产物。当能量由Ca2+-激活光蛋白(Aequorin)传给GFP时引发荧光(Wardetal。，1980)。野生型GFP(wtGFP)的克隆及其在异源系统中等表达使其成为一种新的遗传标记系统(prasheretal.,1992;Inouye&Tsuji,1994a;Wang&Hazelrigg，1994)。当GFP在原核或真核细胞中表达并受到蓝光或紫外光辐照时就可发出亮绿色荧光。GFP色基GFP色基是由丝氨酸酪氨酸甘氨酸(SerTyrGly)形成的环化三肽所构成，并且只有色基包被在完整的GFP蛋白中才能发出荧光(Codyetal.,1993)，被切断的GFP(即使是C末端的少数几个氨基酸)亦能导致GFP失去发光能力。GFP和GFPS65T的晶体结构研究表明色基紧密地包被在由α折叠围成的β盒中(Ormetal.,1996;Yangetal.,1996)。这一结构提供了色基发射荧光的微环境，该环境排除了基质及氧对色基发光的影响。只具备一级结构GFP是不能发光的，功能性色基的形成是在转录翻译后，并经历一个环化反应和一个需分子氧的氧化步骤。色基高级结构的形成可能是荧光蛋白形成的限速步骤，特别是分子氧受到*时(Heimetal.,1994;Davisetal.,1995)。wtGFP吸收紫外和蓝光，其吸收峰为λmax＝395nm和λmin＝470nm，发射峰为λ＝509nm。EGFP是GFP突变系(1)RedShifted(红偏移)GFP突变系(EGFP&GFPS65T)色基发生了氨基酸取代，λmax(Excitation)偏移至490nm附近。红偏移突变系的最大激发峰都落在常用滤色片的波长范围内，所以获得的荧光信号要比wtGFP明亮得多。同样，FACS和共焦显微镜的氩离子光源的发射波长为488nm，对RedShifted突变系的激发效率也明显高于wtGFP。EGFP发生了双氨基酸取代，Leu(亮氨酸)取代Phe64(苯丙氨酸)，Thr(苏氨酸)取代Ser65(丝氨酸)(Cormacketal.,1996)。基于等量溶解蛋白的光谱分析，由于Em(消光系数)的增加和色基构型的高效率，EGFP在488nm处激发后灯荧光强度为wtGFP的35倍(Cormacketal.,1996;Yangetal.,1996)。在相同条件下(489nm)测得EGFP得Em为53，000cm-1M-1，而wtGFP为9，500CM-1M-1，GFPS65T为55，000cm-1M-1(Pattersonetal.,1997)。EGFP的色基构型在37℃比wtGFP或GFPS65T发光效率更高，在这一温度下表达的EGFP可溶性蛋白95%为有效色基(Pattersonetal.,1997)。GFPS65T为Thr取代Ser65的突变体(Heimetal.,1995)，同样条件下，它的荧光强度强于wtGFP4～6倍，并且其唯一的Redshifted激发峰位于490nm，但37℃时色基形成的效率不如EGFP。你可以两个都试试，应该都没有问题的上边的我也是看了这个网址后给你发的，我感觉挺好的，还有不明白的，你自己看看吧，那里还有很多东西我没给你拷过来.cn/periodical/periodical.articles/jgswxb/jgsw99/jgsw9903/990315.htm