用原核载体克隆并表达一种生物中的某个基因(序列已知),这种生物若是一种原核生物,应如何设计实验?

发布网友发布时间：2022-04-28 14:59

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热心网友时间：2023-09-11 11:54

原核表达是目前最常用的表达系统，一般在大肠杆菌中做，也有在酵母，乳酸菌或者真核细胞里面做。大肠杆菌是工程菌，易操作，不会存在质粒转不进去的情况。因为酵母，乳酸菌等细胞内部一般都存在*修饰系统，不是所有的工程质粒都能应用，所以必须找对应的质粒和配套的工程菌株。
大肠就不一样，随便搞。克隆质粒非常非常多，一般选实验室有的，或容易得到的。表达载体也很多，pET系列，pGEX系列，pCold系列等；表达菌也很多，一般BL21系列就足够了，当然有特殊要求的可以在试试其他菌。

好了，我说一下我的步骤。
首先不管是真核还是原核的靶基因，只要对表达菌没有太大损伤，都能在原核表达，前几天我表达一个蛋白一直不成功，就有可能是因为这个蛋白是一种原核胞内酶，对细胞有毒性作用。
然后设计引物将序列已知从细菌或者真核细胞细胞PCR扩增出来（当然了，要先提取基因组），将扩增出来的产物连进克隆载体，转进感受态，培养以扩增拷贝数，这样就可以得到大量的质粒。
然后提取质粒，将目标片段从克隆载体上切下来（内切酶酶切），然后连进表达载体，转进表达菌。
第三步，诱导表达，将含有质粒的表达菌培养，OD在0.55-0.7之间时，加诱导物（IPTG），细菌就表达这个蛋白了，培养一段时间后，收集。
第四步，破碎收集的细菌（一般超生破碎），破碎后的细菌蛋白就释放出来了，然后将蛋白通过不同的纯化方法纯化出来，就得到你的目标蛋白了。

我个人真核原核没啥区别，
有问题我们在讨论。
~.~