细胞活力测定常用的简便方法是

发布网友 发布时间：2022-04-22 03:15

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热心网友 时间：2024-03-26 06:00

培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。
 
在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。
 
用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。
实验材料
细胞悬液
试剂/试剂盒
台盼兰 四甲基偶氮唑盐 酸化异丙醇
仪器/耗材
普通显微镜 血球计数板 试管 吸管 酶标仪 分光光度计
实验步骤
一、细胞计数
 
1.  将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。
 
2.  将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。
 
3.  静置3分钟。
 
4.  镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：
 
细胞数/ml=4大格细胞总数/ 4×10 000
 
注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。
 
二、细胞活力
 
1.  将细胞悬液以0.5 ml加入试管中。
 
2.  加入0.5 ml 0.4%台盼兰染液，染色2-3分钟。
 
3.  吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。
 
4.  镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。
 
死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。
 
活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。
 
三、MTT法测细胞相对数和相对活力
 
活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使MTT分解产生兰色结晶状甲赞颗粒积于细胞内和细胞周围。其量与细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比。
 
1.  细胞悬液以1 000 rpm离心10分钟，弃上清液。
 
2.  沉淀加入0.5-1 ml MTT，吹打成悬液。
 
3.  37℃下保温2小时。
 
4.  加入4-5 ml酸化异丙醇（定容）。打匀。
 
5.  1 000 rpm离心，取上清液酶标仪或分光光度计570 nm比色，酸化异丙醇调零点。
 
注意：MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。
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注意事项
1.镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。

2.死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。

热心网友 时间：2024-03-26 05:57

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热心网友 时间：2024-03-26 06:01

根据每个细胞有一定的重量而设计的。
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它可以用于单细胞、多细胞以及丝状体微生物生长的测定。将一定体积的样品通过离心或过滤将菌体分离出来，经洗涤，再离心后直接称重，求出湿重，如果是丝状体微生物，过滤后用滤纸吸去菌丝之间的自由水，再称重求出湿重。
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不论是细菌样品还是丝状菌样品，可以将它们放在已知重量的平皿或烧杯内，于105℃烘干至恒重，取出放入干燥器内冷却，再称量，求出微生物干重。如果要测定固体培养基上生长的放线菌或丝状真菌，可先加热至50℃，使琼脂熔化，过滤得菌丝体，再用50℃的生理盐水洗涤菌丝，然后按上述方法求出菌丝体的湿重或干重。
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除了干重、湿重反映细胞物质重量外，还可以通过测定细胞中蛋白质或DNA的含量反映细胞物质的量。蛋白质是细胞的主要成分，含量也比较稳定，其中氮是蛋白质的重要组成元素。从一定体积的样品中分离出细胞，洗涤后，按凯氏定氮法测出总氮量。
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蛋白质含氮量为16％，细菌中蛋白质含量占细菌固形物的50％一80％，一般以65％为代表，有些细菌则只占13％一14％，这种变化是由菌龄和培养条件不同所产生的。
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因此总含氮量与蛋白质总量之间的关系可按下列公式计算：蛋白质总量＝含氮量×6.25核酸DNA是微生物的重要遗传物质，每个细菌的DNA含量相当恒定，平均为8.4×`10^(-5)`NG。
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因此从一定体积的细菌悬液中所含的细菌中提取DNA，求得DNA含量，再计算出这一定体积的细菌悬液所含的细菌总数
细胞活力即在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比。

在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力.
检测意义
由组织中分离细胞检查活力以了解分离过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查细胞活力，了解冻存和复苏的效果。
鉴定方法
染色排除法（最常用）
台盼蓝法：死细胞染成蓝色，活细胞不着色
苯胺黑法：死细胞染成黑色，活细胞不着色
伊红Y法：
荧光排除法：
生活力强的细胞能发出强烈的黄绿色荧光；生活力弱的细胞发出荧光也较弱；死亡细胞无荧光。
细胞内酶与特定试剂的显色反应：
MTT比色实验：琥珀酸脱氢酶可使MTT分解产生兰色结晶状甲赞颗粒积于细胞内和细胞周围，其量与细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比
克隆形成试验
计算公式
活细胞率 =（细胞总数-死细胞数）/ 细胞总数 x 100%

热心网友 时间：2024-03-26 05:59

MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。
缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。
细胞活力常用百分比表示，活力的大小对试验结果有很大影响。细胞活力的测定有许多方法，最简便常用的方法是台盼蓝（trypanblue）染色法。台盼蓝又称锥蓝，是一种阴离子型染料，这种染料不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色，但死亡细胞的细胞膜通透性增加，可使染料通过细胞膜进入细胞内，使死细胞着色呈蓝色。