如何提取dna
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发布时间：2022-04-22 04:40
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时间：2022-05-12 22:43
DNA提取主要是CTAB方法，其他的方法还有物理方式如玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法。化学方式如异硫氰酸胍法、碱裂解法。生物方式：酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有；硅质材料、阴离子交换树脂等。
提取DNA总的原则:
1.保证核酸一级结构的完整性；
2.核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；
3.其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；
4.其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。
例如 : 用酶法提取
DNA提取分为三个基本步骤，每个步骤的具体方法可根据样品种类、影响提取的物质以及后续步骤的不同而有区别。
工具/原料: 研磨棒、研磨仪或者组织破碎仪 , 氯仿：异戊醇（24:1）或者蛋白酶 , RNA酶 , 酒精 , 冰箱
方法/步骤 :
使用研磨仪、研磨棒或者使用超声破碎细胞的方法破碎细胞，加入去污剂，如sds等，除去膜脂。
去除细胞内的蛋白质，包括与DNA结合的组蛋白，通过加入蛋白酶，醋酸盐沉淀，或者酚／氯仿抽提等方法去除。
加入RNA酶去除RNA，如实验不严密，可省略此步。
沉淀DNA，需在冷乙醇或异丙醇中沉淀，放在冰箱-20℃沉淀30分钟以上，原理是DNA在醇中不可溶而黏在一起发生沉淀。
总结: DNA提取方法有下面⑦种
一.酚抽提法：先用蛋酶K、SDS破碎细胞，消化蛋白，然后用酚和酚-氯DNA大小为100-150kb
二.甲酰胺解聚法：破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，再透析获得DNA可得DNA200kb左右。
三.玻璃棒缠绕法：用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于乙醇上，然后用带钩或U型玻璃棒在界面轻搅，DNA沉淀液绕于玻棒。生成DNA约80kb。
四.异丙醇沉淀法：基本同1法，仅用二倍容积异丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在异丙醇中可溶状态）
五.表面活性剂快速制备法：用Triton X-100A或NP40表面活性剂破碎细胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。
六.加热法快速制备：加热96℃-100℃，五分钟，然后离心后取上清，可用于PCR反应。
七.碱变性快速制备：先用NaOH作用20分钟，再加HCI中和，离心后取上清，含少量DNA。
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时间：2022-05-13 00:01
一）CTAB法
CTAB是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇。
（二）SDS法
利用高浓度的SDS，在较高温度（55—65℃）条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的做法使蛋白质及多糖杂质沉淀（最常用的是加入5M的KAc于冰上保温，在低温条件下KAc与蛋白质及多糖结合成不溶物），离心除去沉淀后，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。
以下是在提取热带水果DNA时设计的两种不同方法步骤，对比起来CTAB法好，在禾本科植物效果差不多！
1、 CTAB法
1） 在所需量的CTAB抽提液中加入2－巯基乙醇，使终浓度达2％（v/v）。将此溶液预热至65℃。
对于每克新鲜的叶组织大约需要4ml的2－ME/CTAB抽提液。
2） 用液氮（－196℃）或干冰（－78℃）冷却粉碎器/匀浆器，将0.5 g植物组织粉碎成细粉，然后将组织转移到2.0 ml离心管。
3） 加入800 µl预热的2－Me/CTAB，混合使之充分湿润，于65℃温育20 min，不时颠倒混匀。
4） 待冷至室温后，加入800 µl氯仿/异戊醇（24：1），颠倒混匀至溶液呈乳浊状----但不要振荡。25℃，10000 rpm离心10 min。
5） 上清（~700 µl）转移至另一干净的离心管中，加入5 µl RNaseA贮液，37℃温育30 min。
6） 加入700 µl氯仿/异戊醇，颠倒混匀，25℃，10000 rpm离心10 min。
7） 上清（~600 µl）转移至另一干净的1.5 ml离心管中，加入600 µl异丙醇，颠倒混匀，室温或-20℃放置20 min。
8） 25℃，12000 rpm，离心10 min，收集沉淀。
9） 去上清，加1 ml70%乙醇洗涤沉淀两次。（25℃，12000 rpm，离心10 min）
10）凉干DNA，溶于50 µl ddH2O，4℃保存备用。
2、 SDS法
① 将0.3 g植物材料于液氮速冻，然后在研钵中将其磨碎，将粉末转至2 ml离心管中。
② 加入1.2 ml预热至65℃的提取缓冲液（其中加入3 μl β—巯基乙醇，增加DNA的稳定性），置65℃水浴中放置30分钟，不时颠倒混匀。。
③ 加入0.45 ml 5M的醋酸钾，混匀，冰浴20分钟，在10000 rpm离心20 min。需要的话，Miracloth纱布过滤除去沉淀，上清液转入另一离心管中。
④ 加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻轻颠倒混匀，12000 rpm离心15 min。
⑤ 转移上清液到另一新离心管中，加5 μl RNaseA贮液，37℃温育30 min。
⑥ 加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻轻颠倒混匀，12000 rpm离心15 min。
⑦ 转移上清液到另一新离心管中，加入0.7V异丙醇，轻轻颠倒混匀，-20℃放置30分钟沉淀核酸。
⑧ 25℃，12000 rpm，离心10 min，收集沉淀。
⑨ 弃上清，70％乙醇洗两次。
⑩ 凉干DNA，溶于50 µl ddH2O，4℃保存备用。
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时间：2022-05-13 01:36
1植物组织提取基因组DNA
一、材料
幼嫩叶子。
二、设备
移液器，冷冻高速离心机，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，50ml离心管（有盖）及5ml和1.5ml离心管，弯成钩状的小玻棒。
三、试剂
1、提取缓冲液Ⅰ：100mmol/L Tris·Cl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS。
2、提取缓冲液Ⅱ：18.6g葡萄糖，6.9g二乙基二硫代碳酸钠，6.0gPVP，240ul巯基乙醇，加水至300ml。
3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇
4、 RnaseA母液
5、其它试剂：液氮、异丙醇、TE缓冲液，无水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。
四、操作步骤：
1. 在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液Ⅰ, 60℃水浴预热。
2. 幼苗或叶子5-10g, 剪碎, 在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中, 剧烈摇动混匀, 60℃水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高), 不时摇动。
3. 加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 颠倒混匀(需带手套, 防止损伤皮肤)，室温下静置5-10分钟, 使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。
4. 室温下5000rpm离心5分钟。
5. 仔细移取上清液至另一50ml离心管,加入1倍体积异丙醇,混匀,室温放置片刻即出现絮状DNA沉淀。
6. 在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,在干净吸水纸上吸干,转入含TE的离心管中,DNA很快溶解于TE。
7. 如DNA不形成絮状沉淀,则可用5000rpm离心5分钟, 再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀,往往难溶解于TE,可在60℃水浴放置15分钟以上，以帮助溶解。
8. 将DNA溶液3000rpm离心5分钟, 上清液倒入干净的5ml离心管。
9. 加入5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃ 10分钟, 除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。
10. 加入1/10体积的3mol/L NaAc及2×体积的冰乙醇,混匀,-20℃放置20分钟左右,DNA形成絮状沉淀。
11. 用玻棒捞出DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再在干净吸水纸上吸干。
12. 将DNA重溶解于1ml TE, -20贮存。
13. 取2μl DNA样品在0.7% Agarose胶上电泳, 检测DNA的分子大小。同时取15μl稀释20倍, 测定OD260/OD280, 检测DNA含量及质量。
[注意] 5g样品可保证获得500μg DNA, 足供RFLP、PCR等分析之用。
