His标签蛋白纯化那些事儿,你知道吗?
发布网友
发布时间：2024-10-24 09:40
共1个回答
热心网友
时间：2024-10-29 23:53
在进行His标签纯化时，推荐的缓冲液条件是：Binding buffer为20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 20–40 mM imidazole, pH 7.4；而Elution buffer则为20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 500 mM imidazole, pH 7.4。His标签在中性或碱性条件下与Ni2+结合力更强，所以推荐使用磷酸缓冲液。
镍柱的蛋白结合载量为至少40mg (His) 6重组蛋白，可以根据填料的结合载量选择预装柱和填料的规格。如果目标蛋白中的咪唑需要去除，可以选择适合的上机脱盐柱或手动脱盐柱。
HisTrap柱子应储存在20%乙醇中，于4℃-30℃条件下，以确保其长期稳定。使用柱子后，正常用缓冲液冲洗即可再次使用。如果柱子出现堵塞、变色等问题，需进行脱镍和挂镍操作，推荐使用20 mM sodium phosphate， 0.5 M NaCl， 50 mM EDTA， pH 7.4的stripping buffer清洗柱子，然后用binding buffer和蒸馏水清洗。
如果裂解液粘性过高，可以使用连续超声或加入5 μg/ml的DNase I、1 mM的Mg离子在冰上孵育来降低粘性。如果目的蛋白不挂柱，可能是His标签没有充分暴露或丢失，可通过加入尿素或盐酸胍等变性剂检查，或者调整His标签的位置。缓冲液条件不合适、洗脱时间过短、样品量过大等情况也可能导致此问题。在纯化过程中，若蛋白挂柱后洗脱不下来，可能是洗脱条件太温和或蛋白在柱子中沉淀，此时可调整咪唑浓度或pH值，使用添加剂或改变NaCl浓度，或尝试在变性条件下洗脱。对于洗脱不纯的蛋白，需要检查是否被蛋白酶降解，是否存在高度亲和镍离子的污染物，或有相互作用的污染物，这时可以通过增加添加剂浓度或使用离子交换层析、分子筛进一步纯化。
优化金属离子和宿主蛋白中His标签的结合能力，可以提高蛋白纯度。若遇到纯度问题，尝试更换成结合能力较弱的Co2+，以减少宿主蛋白的杂质。
以上是一些His标签纯化过程中的常见问题及解决策略，希望能帮助你提升蛋白纯化的成功率。如果你有任何疑问或需要进一步的帮助，欢迎咨询优宁维代理的Ni Sepharose FF 填料。
热心网友
时间：2024-10-29 23:54
在进行His标签纯化时，推荐的缓冲液条件是：Binding buffer为20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 20–40 mM imidazole, pH 7.4；而Elution buffer则为20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 500 mM imidazole, pH 7.4。His标签在中性或碱性条件下与Ni2+结合力更强，所以推荐使用磷酸缓冲液。
镍柱的蛋白结合载量为至少40mg (His) 6重组蛋白，可以根据填料的结合载量选择预装柱和填料的规格。如果目标蛋白中的咪唑需要去除，可以选择适合的上机脱盐柱或手动脱盐柱。
HisTrap柱子应储存在20%乙醇中，于4℃-30℃条件下，以确保其长期稳定。使用柱子后，正常用缓冲液冲洗即可再次使用。如果柱子出现堵塞、变色等问题，需进行脱镍和挂镍操作，推荐使用20 mM sodium phosphate， 0.5 M NaCl， 50 mM EDTA， pH 7.4的stripping buffer清洗柱子，然后用binding buffer和蒸馏水清洗。
如果裂解液粘性过高，可以使用连续超声或加入5 μg/ml的DNase I、1 mM的Mg离子在冰上孵育来降低粘性。如果目的蛋白不挂柱，可能是His标签没有充分暴露或丢失，可通过加入尿素或盐酸胍等变性剂检查，或者调整His标签的位置。缓冲液条件不合适、洗脱时间过短、样品量过大等情况也可能导致此问题。在纯化过程中，若蛋白挂柱后洗脱不下来，可能是洗脱条件太温和或蛋白在柱子中沉淀，此时可调整咪唑浓度或pH值，使用添加剂或改变NaCl浓度，或尝试在变性条件下洗脱。对于洗脱不纯的蛋白，需要检查是否被蛋白酶降解，是否存在高度亲和镍离子的污染物，或有相互作用的污染物，这时可以通过增加添加剂浓度或使用离子交换层析、分子筛进一步纯化。
优化金属离子和宿主蛋白中His标签的结合能力，可以提高蛋白纯度。若遇到纯度问题，尝试更换成结合能力较弱的Co2+，以减少宿主蛋白的杂质。
以上是一些His标签纯化过程中的常见问题及解决策略，希望能帮助你提升蛋白纯化的成功率。如果你有任何疑问或需要进一步的帮助，欢迎咨询优宁维代理的Ni Sepharose FF 填料。
