DELopen文献解读 | 稻瘟病菌Mps1蛋白小分子抑制剂的发现
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发布时间：2024-10-01 14:13
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时间：2024-10-29 06:22
中国农业大学的研究团队与药明康德DELopen平台深度合作，于近日在《mBio》发表了研究论文。该研究利用DEL技术迅速发现稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）的小分子活性抑制剂。稻瘟病是水稻栽培中最具破坏性的病害之一，激酶蛋白Mps1是稻瘟病菌侵染水稻所必需，因此是有潜力的杀菌剂靶点。通过DEL技术，作者发现了Mps1的小分子结合剂A378-0，并验证其可有效抑制稻瘟病菌的致病。此外，A378-0也表现出对镰刀病菌的Mps1同源蛋白Mpk1的抑制能力，表明A378-0具有作为广谱杀菌剂的苗头化合物的潜力。该研究也验证了DEL技术可应用于农业领域、助力靶标农药的开发。
02、研究背景
稻瘟病威胁着全世界的水稻生产，化学防治是目前主要的控制策略之一。稻瘟病菌基因组的高突变率导致了其耐药性的出现，所以确定新的杀菌剂靶点对于克服耐药性和提高食品安全性至关重要。在稻瘟病菌的生命周期中，侵染期是其成功入侵植物寄主的关键时期，因此在这一时期起作用的蛋白是杀菌剂开发的重要靶点。Mps1是稻瘟病菌的三种丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）之一，缺失Mps1的稻瘟病菌虽能正常形成附着孢、但无法穿透植物表面，从而使得稻瘟病菌丧失致病力。
03、DELopen 助力筛选Mps1抑制剂
作者使用药明康德面向学术机构免费提供的DELopen试剂盒对靶点Mps1蛋白进行DEL筛选。根据操作指南在实验室完成DEL筛选实验后，作者将筛选后的样品寄送给药明康德HitS事业部，由HitS进行后续的样品处理、NGS测序及数据分析。
经过DEL筛选与数据分析，本次共发现3个表现突出的分子（富集值>100，拷贝数>10，背景噪音<20）。其中分子A378-0的拷贝数和富集值表现突出，且理化性质基本符合“里宾斯基五规则”，被用于进行后续合成和验证。
作者通过表面等离子共振（SPR）实验验证了A378-0与Mps1蛋白的体外互作，平衡解离常数[KD]为69.2 μM。而Mps1与ATP类似物AMP-PNP的KD值低于500 μM，证明了Mps1和A378-0之间的结合能力远高于Mps1和AMP-PNP或ATP的结合能力。作者又进一步合成了Mps1的底物特征肽段，验证了A378-0可以抑制Mps1的激酶活性。
04、Msp1/A378-0 复合物的共晶结构和相互作用分析
作者解析了A378-0与Mps1的复合物结构并分析其相互作用。Mps1有两个结构域，即N-lobe和C-lobe。A378-0结合在N-lobe和C-lobe之间的口袋中。A378-0与Mps1之间的相互作用主要是氢键相互作用。A378-0和Mps1之间有七个直接形成的分子间氢键，还有由两个水分子介导的分子间氢键相互作用。两个水分子各与四个氮原子或氧原子相互作用，形成两个金字塔状结构，从而提高三维稳定性。除了氢键外，疏水相互作用也参与了在Mps1的N-lobe和C-lobe之间稳定A378-0。
作者随后对Mps1进行了突变研究。SPR结果显示，对形成氢键的四个氨基酸残基Q31、K52、E70、D167进行突变后，A378-0与Mps1的亲和力显著降低，证明了这几个氨基酸位点对于Mps1与A378-0结合的重要性，也验证了Mps1/A378-0结构模型的准确性。
05、A378-0的活性评价
为了验证A378-0能否抑制稻瘟病菌的致病力，作者设计了一系列实验以观察其在病菌侵染过程中的表现。通过模拟植物疏水表面，发现A378-0不能抑制稻瘟病菌的分生孢子发育成附着孢，但能够抑制附着胞入侵水稻，这也符合其他文献中对Mps1功能的报道。水稻叶片接种实验证明，50 μg/mL的A378-0即表现出对水稻叶片上的稻瘟病菌致病力的抑制作用。随着浓度提高到150 μg/mL，稻瘟病菌完全失去致病力。
06、总结
研究方通过筛选DELopen试剂盒，成功发现了Mps1的结合抑制化合物A378-0，并通过后续的实验分析，证明该化合物不仅可以抑制稻瘟病菌的生物活性，更有望成为防治多种病菌的广谱杀菌剂。DEL技术为农业杀菌剂的发现提供了更多可能性。
