关于反转录,你了解多少?

发布网友发布时间：2024-09-25 15:20

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热心网友时间：2024-11-23 13:40

RT-PCR的全称是Reverse Transcription-PCR，指的是以RNA作为模板进行反转录后再进行PCR扩增的技术。而qPCR则代表实时荧光定量PCR，其特点是PCR过程中每轮循环都记录数据，从而精确分析起始模板数量。Real time PCR通常缩写为qPCR，与qPCR定义相同。RT-qPCR或Real time RT-PCR（qRT-PCR）指的是反转录反应与实时荧光定量PCR的结合，即先进行反转录，再使用cDNA进行实时荧光定量PCR分析。

反转录是RT-qPCR实验的关键步骤，因为没有完成转录的RNA在后续实验中无法检测。反转录得到的cDNA可以用于多种实验，如基因表达水平检测、RNA病毒含量分析、cDNA探针合成、基因克隆、cDNA文库构建等。反转录实验受到多种因素影响，包括模板、引物、酶及反应条件等。

影响反转录效率的因素有模板的RNA结构、RNA质量、引物选择、酶特性和反应条件。模板中复杂的二级结构会影响反转录酶的活性，而高质量的RNA、合适的引物、具有高聚合酶活性、热稳定性和保真性的反转录酶以及适宜的反应条件是关键因素。艾科瑞生物的Evo M-MLV Plus / II / III Rtase在常规条件下仍能很好地处理具有复杂二级结构的模板。

RT-qPCR有两种类型：一步法RT-qPCR和两步法RT-qPCR。反转录产物的浓度值检测意义不大，因为除了cDNA外还包含其他反应成分。根据RNA浓度推测cDNA浓度，并通过预实验确定Ct值在15-35之间的稀释倍数作为后续实验的参考。cDNA应在-20℃或-80℃下保存，并避免反复冻融。在qPCR实验中，cDNA原液加入量不应超过反应体系的10%，以避免对后续扩增效率的影响。

总的来说，建立高效反转录反应需要考虑高质量的RNA模板、合适的反转录酶、适当的反应条件以及对所有影响因素的注意事项。通过优化这些因素，可以反转录出适用于后续实验的高质量cDNA。