反转录PCR操作步骤

发布网友发布时间：2024-08-29 03:41

共1个回答

热心网友时间：2024-08-30 21:08

PCR操作的反转录步骤分为两个主要阶段：总RNA的提取和cDNA第一链的合成，以及随后的PCR反应。

首先，从样本中提取总RNA。通常取1-5微克RNA，加入DEPC H2O至11微升，再加入Oligo（dT）12-18进行混合。将混合液加热至70℃10分钟后，迅速冷却至冰浴。接下来，按照配方加入SuperScriptTM Preamplification System试剂，包括PCR buffer、MgCl2、dNTP、DTT和SuperscriptⅡ酶，42℃孵育50分钟后，70℃终止反应，再用RNase H处理以去除RNA残余。最后，将反应混合物保存在-20℃备用。

进入PCR阶段，取0.5ml PCR管，加入第一链cDNA、引物、dNTPs、缓冲液和Taq酶，确保总体积为50微升。设定合适的PCR循环温度，通常进行28-32次循环，以扩增目的基因。同时，为了校准和保证结果准确性，可以加入内参基因的特异性引物进行同步扩增。扩增完成后，通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，使用紫外灯观察条带。最后，通过凝胶图像分析系统扫描并分析电泳结果。

扩展资料

RT-PCR反应原理[1]反转录PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）又称为逆转录PCR。其原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 RT- PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）即逆转录PCR，是将RNA的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增反应（PCR）相结合的技术。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞/组织中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。