qPCR那点事儿!
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发布时间：2024-09-05 06:41
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时间：2024-11-03 16:13
Real-time qPCR，即在PCR扩增过程中，通过荧光信号对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和起始拷贝数存在线性关系，因此成为定量的依据。由于常规PCR的缺点，real-time qPCR以其操作简便、灵敏度高、重复性好等优点迅速发展。现在已广泛应用于生命科学研究的各个领域，如基因差异表达分析、SNP检测、等位基因检测、药物开发、临床诊断、转基因研究等。
在Real-time qPCR技术的发展过程中，定量PCR仪的发展发挥了至关重要的作用。1995年，美国PE公司（已并入Invitrogen公司）成功研制了Taqman技术，1996年推出了首台荧光定量PCR检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，通过Ct值进行数据分析。现在，定量PCR仪有ABI7000、7300、7500、7700、7900HT、StepOnePlusTM、StepOneTM、PRISM@StepOneTM系列；BIO-RAD的CFX96、iCycler iQ5@、MyiQ@、MJ Research Chromo4TM Opticon 系列；Stratagene MxTM系列；Roche LightCycler@系列；Eppendorf Masercycler@；Corbett Rotor-GeneTM；Cepheid SmartCycler@和BIOER的LineGene系列。
二、Real-time qPCR概述
1. Real-time qPCR原理：实时PCR在PCR扩增过程中，通过荧光信号对PCR进程进行实时检测。定量PCR仪主要由样品载台、基因扩增热循环组件、微量荧光检测光学系统、微电路控制系统、计算机及应用软件组成。其中，基因扩增热循环组件工作原理与传统基因扩增仪大致相同，不同厂家不同型号的产品分别采用空气加热、压缩机制冷、半导体加热制冷等工作方式。独特的是微量荧光检测系统，由荧光激发光学部件、微量荧光检测部件、光路、控制系统组成。
2. Real-time qPCR的数学原理：Ct值、阈值和基线是Real-time qPCR中的重要参数。第3-15个循环的荧光值是基线，由于测量偶然误差引起。阈值一般是基线的标准偏差的10倍。Ct值是荧光值达到阈值时的PCR循环次数。
3. Real-time qPCR的种类：探针类（TaqMan@探针、分子信标）和非探针类（SYBR@Green I、特殊设计的引物）。
4. Real-time qPCR和常规PCR的区别：实时检测、敏感性高、需要样品少、特异性高、精确定量。
三、Real-time qPCR实验设计
1. 实验材料的处理和准备：对照组（CON）和处理组（TRT），组内要有生物重复。
2. 引物设计：扩增产物长度在80-150bp、引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性、产物不能形成二级结构、产物长度一般在15-30碱基之间、G+C含量在40%-60%之间、碱基要随机分布、引物自身不能有连续4个碱基的互补、引物之间不能有连续4个碱基的互补、引物5’端可以修饰、引物3’端不可修饰、引物3’端要避开密码子的第3位。
四、Real-time qPCR操作过程
1. RNA提取和反转录：全程佩戴一次性手套，使用灭菌的一次性塑料器皿和自动吸管抽提RNA，避免使用公共仪器所导致的RNA酶交叉污染。
2. Mix配制：real-time qPCR MasterMix是2×的浓缩液，只需要加入模板和引物。
3. 仪器设置：反应板设置和程序设置。
五、Real-time qPCR数据分析
1. Real-time qPCR常见参数：基线、阈值、Ct值、Rn、△Rn。
2. 影响Ct值的关键因素：模板浓度、反应液成分、PCR反应效率。
3. 如何评估实时定量PCR反应的效果：PCR扩增效率、R2值、精确度、灵敏度。
4. 评价荧光PCR结果的标准：效率、精密度、灵敏度。
5. Real-time qPCR定量方法：绝对定量、相对定量、2-△△Ct定量、其他定量方法。
六、Real-Time qPCR常见问题分析
1. 无Ct值出现：检测荧光信号的步骤有误、引物或探针降解、模板量不足、模板降解。
2. Ct值出现过晚（Ct＞38）：扩增效率低、PCR各种反应成分的降解或加样量的不足、PCR产物太长。
3. 标准曲线线性关系不佳：加样存在误差、标准品出现降解、引物或探针不佳、模板中存在抑制物，或模板浓度过高。
4. 负对照有信号：引物设计不够优化、引物浓度不佳、镁离子浓度过高、模板有基因组的污染。
5. 溶解曲线不止一个主峰：引物设计不够优化、引物浓度不佳、镁离子浓度过高、模板有基因组的污染。
6. 扩增效率低：反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解、反应条件不够优化、反应体系中有PCR反应抑制物。
7. 同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线，如何判断？判断标准：扩增效率、灵敏度、特异性。
8. 扩增曲线的异常？比如“S”型曲线？参比染料设定不正确、模板的浓度太高或者降解荧光染料的降解。
