PCR 实战宝典 No.5:实时荧光PCR

发布网友 发布时间：2024-08-19 21:17

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热心网友 时间：2024-08-21 20:42

实时荧光PCR：精密技术解锁基因表达与分析新纪元

荧光标记在PCR反应中的积累形成独特曲线，分为背景噪音、指数增长和平台期。在指数增长阶段，荧光信号与模板DNA的拷贝数成线性关系，这成为定量分析的宝贵窗口。其中，关键概念包括基线——反应起始时的稳定信号，荧光阈值——扩增信号达到可测量水平的设定点，以及Ct值——PCR产物达到阈值所需的循环次数，它们共同构成了实时荧光PCR的计算基石。

数学逻辑揭示荧光定量的秘密

荧光定量PCR巧妙地利用荧光强度代替产物的绝对数量，通过Ct值、PCR效率和模板量之间的数学关系，Ct值与模板量呈对数负相关，如同公式y=-kx+b中，lgX0与n(Ct)的线性关系，揭示了PCR反应的内在规律。

荧光标记策略有荧光染料法和荧光探针法两种，前者成本低但可能产生非特异性信号，后者如Taqman探针具有高度特异性，但成本较高。绝对定量分析，如测定拷贝数，需有标准品建立标准曲线；相对定量则聚焦于基因表达变化趋势，无需绝对数值。

实验策略：校正与精准分析

实验过程中，样本差异可能导致模板浓度不一致，这时需要内参基因校正，如β-Actin和18S rRNA，它们在不同条件下的表达保持稳定。实验方法包括双标准曲线法和ΔΔCt法，前者适用于样本量大、目标基因少的情况，后者则简化了后续步骤，前提是扩增效率一致。

引物和探针的设计至关重要，需在保守区域选择，避免二级结构干扰，遵循Tm值、GC含量等参数，以及进行BLAST比对确保特异性。PrimerExpress和Primer Premier5等专业软件在设计过程中扮演了重要角色，通过多对引物和探针的实验验证，确保实验的高效性和准确性。

技术进步与市场领导者

实时荧光PCR技术由Higuchi在1992年开创，如今荧光PCR仪市场由ABI、罗氏(Roche)和伯乐(Bio-rad)等国际巨头主导。选择仪器时，除了考虑通用性、检测通量和成本，还应关注仪器的兼容性、通道数量、易用性等因素。

例如，ABI公司的7700和7500系列以其高灵敏度闻名，但价格不菲；7500 Plus则在板型和红光检测上有所增强。小型而经济的StepOne Plus Plus，虽体积紧凑，却支持96孔PCR，热循环采用珀尔帖效应，确保快速反应。罗氏的LightCycler系列，如LightCycler 1.5-96，以其快速升温和低成本维护而受到青睐。

深入了解这些仪器的特性，可以在《实战宝典》_仪器信息网（www.instrument.com.cn/zt/szbd）找到更多详细对比与指南。