科研小白的进阶之路(1)——Western Blot实验教程

发布网友发布时间：2024-09-27 17:15

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热心网友时间：2024-09-30 04:45

Western Blot（WB）技术是分子生物学中最常用的蛋白质检测方法，它通过电泳将蛋白质按分子量大小进行分离，然后通过抗体免疫杂交和显色反应指示蛋白质的大小和含量，以评估细胞和组织中蛋白的表达情况。

第一步是蛋白提取。提取方法根据目标蛋白类型分为总蛋白提取、核蛋白提取和膜蛋白提取，通常使用总蛋白提取方法即可。提取时需要使用裂解液和蛋白酶抑制剂。裂解液中的成分如Triton X-100、NP-40和SDS等，用于破坏细胞膜，释放并溶解细胞内的蛋白。蛋白酶抑制剂如PMSF、AEBSF、aprotinin等可保护蛋白样本免受降解。对于检测磷酸化蛋白的实验，还需要加入磷酸酶抑制剂。操作步骤包括细胞或组织的裂解、离心，以及蛋白样本的制备和浓度测定。操作过程中应保持低温，以防蛋白降解。

第二步是电泳。通过配置聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，将蛋白质按不同分子量大小进行分离。凝胶配置需要丙烯酰胺-双丙烯酰胺（Arc-Bis）、SDS、Tris-HCl缓冲液、过硫酸铵（APS）和四甲基乙二胺（TEMED）等试剂。浓缩胶和分离胶分别用于将样品聚集至同一电泳起点，并按分子量大小进行分离。分离胶的浓度根据待分离蛋白的分子量选择。在电泳前，蛋白样本需加入上样缓冲液变性，以破坏蛋白质的二级和*结构，确保电泳速度与分子量有关。

第三步是蛋白转印。将电泳后的蛋白质转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，以便进行后续的检测。转印方法包括湿转、半干转和干转，实验室通常使用半干转。转印后，需进行封闭以降低背景噪声，常用2.5-5%脱脂牛奶的TBST溶液。随后进行一抗和二抗的免疫杂交，一抗识别目标蛋白，二抗识别一抗并与辣根过氧化物酶（HRP）结合。HRP作用于化学发光底物形成光信号，通过胶片或成像系统捕捉形成蛋白条带。

最后一步是免疫杂交及检测。完成封闭后，进行一抗和二抗的孵育，一抗识别目标蛋白，二抗识别一抗并与HRP结合，形成光信号。通过胶片或成像系统捕捉形成蛋白条带。实验中需注意封闭液浓度、一抗和二抗的稀释浓度及孵育时间的调整，以及化学发光工作液的稳定性。

华仁医学提供基础医*合科研服务，其科研团队具有成熟的Western Blot实验技术，能够进行高质量蛋白的高效提取，并根据具体情况微调实验参数，确保检测结果客观准确。