干货分享 | 蛋白实验—IP与CO-IP详细概述及结果解读
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发布时间：2024-10-11 08:38
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时间：2024-10-13 00:44
一、基础资料
免疫沉淀（IP）是一种基于抗原和抗体特异性结合的实验技术，用于提取和检测蛋白质。
二、原理
IP利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质“protein A/G”与抗体FC片段的特异性结合开发。通常使用pre-conjugated protein A/G与agarose beads结合，用于与含有抗原的溶液和抗体反应，从而实现抗原的吸附。通过低速离心，可从溶液中分离出目标抗原。
三、类型
1. 个别免疫沉淀法(IP)：用于分离特定已知蛋白。
2. 免疫共沉淀法(CO-IP)：研究蛋白质复合体间的相互作用。
3. 染色质免疫沉淀法(ChIP)：探索特定蛋白与DNA的关系。
4. RNA免疫沉淀法(RIP)：分析与RNA结合的蛋白。
四、主要步骤
1. 收集细胞，用适量裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂）裂解30分钟，12,000g离心30分钟后，取上清。
2. 预留一部分裂解液用于Western blot分析，剩余裂解液加入抗体和proteins A/G-beads，4℃缓慢摇动过夜。
3. 免疫沉淀后，以3,000g速度离心5分钟，移除beads，用裂解缓冲液清洗3-4次，加入2×SDS加样缓冲液，沸水煮10分钟。
4. 进行SDS-PAGE、WB或质谱分析。
五、实验解疑
1. 一般抗体是否适用于IP实验？
答：抗体性质对IP实验影响大，结合能力不同。多抗通常效果最佳，但单抗、腹水和杂交瘤上清液也适用。
2. 缓冲液中添加蛋白酶抑制剂原因？
答：防止样品中蛋白酶分解蛋白质，确保实验在低温下进行，避免蛋白分解。
3. 缓冲液配制注意事项？
答：使用强表面活性剂溶解细胞蛋白，避免影响抗体结合；弱表面活性剂可能使蛋白与抗体结合性差。
4. 如何配制细胞裂解液？
答：选择温和的去污剂如TritonX-100或NP40，考虑蛋白特性优化浓度和盐浓度。
六、常见问题及解决方法
1. 高背景问题：
1) 去除不溶性蛋白残留。
2) 确保珠子充分预封闭。
3) 使用亲和纯化的抗体。
4) 减少细胞或蛋白量。
5) 优化抗体结合条件。
2. 抗体洗脱量大问题：
建议减少抗体用量，使用温和洗脱缓冲液梯度。
3. 无法检测到目的蛋白：
1) 目标蛋白表达量低，增加细胞裂解量。
2) 抗体浓度不足，调整抗体浓度。
免疫共沉淀（CO-IP）
一、基础资料
CO-IP是基于抗体与抗原特异性结合，以及“Protein A/G”结合抗体FC段的原理，用于研究蛋白质复合体间的相互作用。
二、主要步骤
试剂准备，细胞处理，抗体结合，抗原抗体复合物沉淀，清洗，上样，煮沸，电泳分析。
三、实验解疑
1. 抗原未沉淀：确认抗原量、抗体特异性、裂解液成分。
2. 抗体条带掩盖目标蛋白：使用不同种属的抗体。
3. 蛋白量低：加入蛋白酶抑制剂，增加beads量，提高样品量。
4. 多条非特异条带：调整裂解液中NaCl浓度。
5. beads聚集：确保beads充分预洗。
其他问题：Co-IP适用的珠子类型、对照选择、验证方法、分析质谱结果、互作验证、Co-IP结果解读。
