药用真菌培育的一般设备和基本操作技术是什么?

发布网友 发布时间：2022-05-10 20:38

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热心网友 时间：2023-10-29 23:14

（冉砚珠）

药用真菌培育的基本设备及操作技术和一般微生物培养相同。

一、一般设备

（一）无菌室（接种室）

这是进行无菌操作的场所，无菌室要求严密，一般以4—5m2大小为宜，四壁最好涂以白漆，室内要整齐、干净，不要有对流空气，室内要安装灭菌用的紫外光灯和照明用的日光灯，并设有操作台和凳子，在无菌室门外最好再有小一倍的缓冲间，以防外面的空气袭入无菌室，二者的门不要对开，以左右的推拉门为好，这种无菌室一般设立在距菌室很近的菌种培养室的旁边。

（二）无菌箱

无菌箱也称接种箱（柜），是一木制架玻璃柜，是代替无菌室的。在箱内的两侧设有能滑动启闭的活门，在箱的前侧底上部有两个圆形手孔，以便接种时把手伸入进行操作。在箱内上壁最好按一支紫外光灯和日光灯管。无菌箱的边角应严密，不得有缝隙，以免杂菌侵入。

无菌室和无菌箱在使用前必须经过杀菌。

（三）超净工作台

这也是进行无菌操作的装置，有各种型号和规格，有的适合单人操作，有的适合双人操作。它可以设置在无菌室或一般的房间中，但要求所处的环境空气流动较小、干燥、尘埃稀少，最好不要有人来回走动。这种装置在目前微生物和组织培养研究工作中普遍应用。

（四）杀菌设备

须有高压蒸汽灭菌锅，条件不足，亦可用蒸锅代替。主要用于培养基及玻璃器皿灭菌时使用。

（五）温箱和培养室

用于保温培养。根据不同目的选用不同设备。一般药用真菌母种的培养在温箱内进行，而子实体的培养就需要利用培养室。长子实体阶段，空气湿度要高，故培养室最好是水泥池，有水源并有下水道和通风换气的条件。此外设瓶架，备照明灯以及温、湿度计等。

（六）干燥设备

烤箱、烤房等。

（七）常用的玻璃器皿

1.试管

用于培养斜面菌种。常用为180×20mm及150×15mm两种。

2.三角瓶

有100ml、500ml、1000ml及5000ml等规格。用于装无菌水和培养基。

3.培养皿

供平面培养用。常用的为直径9cm培养皿。

4.吸管

用于稀释分离菌种。有1ml和10ml。

5.玻璃漏斗

用于过滤和分装培养基用。

6.酒精灯

用于接种工具的火焰灭菌。

7.其它用品

尚需纱布、棉花、镊子、剪刀、线绳、试管架、天平、载玻片、盖玻片、显微镜等。

如开展深层发酵，除上述设备外，尚需有摇瓶机、种子罐、发酵罐、过滤用的板框或离心机以及其它有关设备。

二、基本操作技术

（一）玻璃器皿的准备和清洁

玻璃器皿的清洁与否直接影响实验结果，在使用前均需洗刷干净或再经灭菌、晾干或烘干后备用。新购买的玻璃器皿都有游离的碱性物质，最好的洗涤办法是用1%的HC1溶液处理一次，再用清水洗净。

1.重铬酸钾洗涤液的配制

浓配法：

重铬酸钾（工业用） 40g

浓硫酸（工业用） 800ml

自来水 160ml

稀配法：

重铬酸钾（工业用） 50g

浓硫酸（工业用） 100ml

自来水 250ml

将重铬酸钾溶解在水中，慢慢加入浓硫酸，边加边搅动（注意不可将重铬酸钾溶液往浓硫酸里倾倒，以免烧伤）。配好后贮存于广口瓶内，盖紧塞子备用。应用此液时，器皿必须干燥，同时应注意不要把大量还原物质带入。配好的溶液呈红色，浓厚并有红色小结晶。

2.各种玻璃器皿的洗涤

染菌或盛有药用真菌的器皿，先放入高压锅内灭菌20—30分钟，趁热倒出培养物再用热肥皂水洗刷并冲洗干净。以瓶壁不挂水珠为准。

含有凡士林和蜡的器皿，需要预先除去油腻，必要时在5%苏打液内煮后再用热肥皂水洗刷。若作精密的试验或装化学药品时，则先用洗涤液浸泡，自来水、蒸馏水冲洗后烘干备用。

带菌的移液管，应立即投入5%石炭酸溶液灭菌一天，再用自来水冲洗。

新的载玻片和盖玻片，先浸于肥皂水（或盐酸酒精）内1小时，用水冲洗后软布擦干保存于95%酒精中。

（二）培养基的配制

培养基是根据药用真菌生长繁殖所需要的各种营养物质用人工配制的机质。其中除含有水分、碳水化合物，含氮化合物和少量无机盐类外，有时还需要各种必要的维生素。

碳源是药用真菌的重要营养来源，它不但是合成碳水化合物及氨基酸的重要成分，而且也是生命活动的能量来源。

氮素是合成蛋白质及核酸的重要原料，药用真菌生长发育的不同阶段，对碳氮比例的要求是不同的。在营养生长阶段，要求碳氮比为20∶1左右；在生殖生长阶段，则要求碳氮比为30∶1—40∶1。不同的药用真菌，对碳氮比的要求也各有不同。决定碳氮比因素有两个：一是细胞内成分的碳氮比，二是决定于真菌的不同种类对碳氮元素的同化能力。

某些无机盐如钾、钠、钙、镁等磷酸盐和硫酸盐，虽然需要量很少，但也有助于药用真菌的生长发育。硫胺素（维生素B1）是碳代谢中转羧酶的重要成分，因此在配制培养基时，必须考虑到药用真菌的营养要求。

培养基的种类很多，凡利用含有丰富营养的天然有机物质制成的培养基称为天然培养基，如马铃薯、麸皮、豆饼粉等。利用已知成分和数量的化学药品配制的培养基为合成培养基，如察氏培养基。但一般是采用一部分天然物质作为碳源、氮源及生长因素的来源，再适当添加一些无机盐类，称为半合成培养基，例如去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸镁0.75g；维生素B110mg，琼脂18g，水1000ml。

培养基除了满足药用真菌的营养条件外，还要注意调节适宜的酸碱度。一般常用的培养基有固体及液体两种。

（三）消毒灭菌

为了分离得到所需要的药用真菌，并进行纯培养，所用的器皿及培养基都必须严格的消毒灭菌，杀死其中的微生物。

1.干热灭菌

主要在烤箱中进行。适合于玻璃器皿如吸管、培养皿、试管、三角瓶等，灭菌前器皿必须用纸包装好，温度慢慢上升，要求控制在160℃，保持1小时即可。灭菌后待温度下降至60℃以下方可取出物品，以免温度突然下降造成器皿的炸裂。

2.湿热灭菌

由于湿热的穿透力比干热的穿透力强，所以含有水分的培养基就采用这种方法。一般液体及琼脂培养基只要15磅压力半个小时，而锯木屑培养基则消毒时间延长1倍。

3.土法灭菌

是用蒸汽锅（或普通锅）蒸。这一般在没有高压灭菌条件或在高压灭菌破坏培养基的情况下采用。温度只能达100℃左右，为了达到彻底灭菌的目的，一般要进行三次间歇灭菌，每次圆气后保持1小时，然后室温下放置一天，第二天及第三天再各蒸一次。

4.药物灭菌

常用的有70%酒精，0.1%升汞水，10%漂白粉，40%甲醛溶液以及新洁尔灭等。

此外还有火焰灭菌及紫外线灭菌。

（四）接种与培养

空气中杂菌微生物较多，这对药用真菌的纯培养是有害的，接种工作必须在无菌条件下进行。

1.斜面接种

接种时，把待接种用的试管斜面培养基和原菌种并列放在左手中，使中指夹于两试管之间，斜面朝上便于观看，右手拿接种针，蘸酒精在火焰上灼烧片刻（接种针进入试管的部分均要烧到），用右手小指、无名指和手掌拔掉试管棉塞，以火焰微微烤管口一周，使管口可能沾污的杂菌被烧死，这时接种针通过火焰伸入菌种管内稍冷却挑取少许菌丝连同培养基一起，迅速转入待接种的试管内，放在斜面的*处，以利菌丝向四周生长延伸，注意不要使菌种沾靠管壁，然后将棉塞塞好，这就完成了第一管的接种程序。每管接种均如上述。一般每支原菌种管可扩接20支新管，放在恒温箱或恒温室培养。

2.液体接种

就是把菌种从斜面培养基上转接到液体培养基中，再放到适宜条件下振荡培养。接种方法基本同前，伹菌种管可以安置在菌种架上，按一定角度旋紧螺旋，三角瓶略向上斜以免基液流出，将取有菌种的接种小铲送入液体培养基时，用铲的背面在瓶壁靠近培养液处压碎菌块并投入液体中，同样塞上棉塞及灼烧接种工具。每管菌种可接2—3瓶培养液。

如菌种为液体时，常用无菌移液管接种，接种量为10%，接种后放于恒温培养室的摇床上振荡培养。

三、室外作业的一般工具及操作

室外栽培多指段木栽培，一般利用的工具有斧、锯、钻、刮刀及塑料薄膜等。段木栽培要掌握好砍口深浅，稍达木质部为宜，有利菌的生长，砍口或打孔后需立即接种，以保接种质量。