PT-PCR操作流程
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发布时间:2022-04-22 01:04
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时间:2022-05-21 13:19
是RT-PCR啊。
一、实验器具与材料:
1、移液*:1ml、200μl、20μl、10μl、2μl
2、吸头:1ml、200μl、20μl
3、匀浆管:5ml
4、吸头台:放置1ml吸头的一个,放置20μl吸头的一个
5、EP管:1.5ml、0.2ml、100μl
6、试剂瓶:2个60ml的棕色试剂瓶(广口,带盖)
1个125ml的白色试剂瓶(放无水乙醇)
7、量筒:50ml、250ml、500ml
8、容量瓶:250ml、500ml、1000ml
9、试管架:5ml、1.5ml、20μl
10、盐水瓶:250ml、500ml各2个备用,一个装无水乙醇,另一个装DEPC水
11、铝制饭盒:4个
12、塑料小饭盒:1个
13、大瓷缸:2个
14、锡泊纸:一卷
15、卷纸:2卷
16、三角烧瓶:带盖,稍大
二、实验器具的处理与准备
1、塑料制品:(包括*头、EP管、匀浆管等)
先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中,将塑料制品逐个浸泡其中,其中小*头需要吸管打入DEPC水,过夜,然后高压,再烤干备用,实验前将*头等放入吸头台,再高压一次(EP管)
2、玻璃制品:泡酸过夜,冲洗干净,蒙锡纸烤干备用(DEPC水泡)(洗净后先泡1‰DEPC过夜,再烤干)
3、匀浆器:(包括剪刀、镊子)先洗净后,再高压(不需要泡DEPC)
三、试剂配制:
1、DEPC水:吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水,放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。
2、75%乙醇:用无水乙醇 DEPC水配,然后放-20℃保存(其中DEPC水需先高压)
3、异丙醇:放入棕色瓶中
4、氯仿:放入棕色瓶中
5、琼脂糖
四、几种缓冲液的配制:
1、电泳缓冲液:
Tris 54g
硼酸 27.5g
0.5M EDTA 20ml? pH8.0
蒸溜水 1000ml
5×TBE (贮存液)
再将5×TBE稀释10倍成0.5TBE就可以在电泳时使用(即工作液浓度),如取50ml贮存液 450ml水--→500ml工作缓冲液
2、上样缓冲液:
0.25%溴酚蓝
0.25%二甲苯青FF
30%甘油
6×缓冲液,4℃保存
五、琼脂糖凝胶的配制:
1、1.0%:
1.0g琼脂糖 100ml电泳缓冲液,微波炉中火30秒至沸腾,熔化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭2.5μl,充分混匀,将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中,在室温下放置30-45min后现进行电泳。
2、1.5%:
同上,将琼脂糖的量改为1.5g
六、需购置的Rt-PCR材料:
(生工. Tel. 2236106.)
Taq酶(含MgCl2 Buffer) 200u 70.00
dNTP: 1支
oligo(dT)15: 1 OD 40.00 promega
M-MLV: 1支 250.00 promega (Buffer)
RNasin: 1支 110
-- -20℃
DEPC 5g 110.00
Trizol 100ml/1瓶 Invitrogen Life technologies
-- 4℃
Marker: 10μg 0.2μg/ml 150.00 科威
(1543. 994. 697. 515. 377. 231)
七、引物合成
正义:5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′
反义:5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′
2、par-4:
正义:5′-GGGACCTCGGAACTCAAC-3′
反义:5′-TGTATCTGCCTGGGACTG-3′
3、退火温度计算
2(A T) 4(G C)
正反义平均数,再上下波动度(±4℃,或±5℃)
4、引物各合成5 OD,每OD一瓶分装好
5、引物稀释:
加DEPC水量为(μl)
= ? nmol / OD × 管上所标OD数×100
是为10p mol / μl 浓度的引物溶液
八、PCR产物电泳
先将1-10μl左右PCR产物,加已点在纸上的溴酸兰,反复吸打混匀后进行电泳,一般电流为10mA,电源100V,电泳30分钟,紫外灯下观察,满意的结果扫描打印。
九、几个注意点:
1、逆转录的关键步骤是立即冰水浴?
2、Rt时,先打开PCR预热30分钟。
3、RNA抽提前,打开离心机预冷。
TRIzol法抽提总RNA
细胞1×107
组织100mg
↓
加1mlTRIzol
细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块
↓
匀浆(要彻底,后转至EP管)
(组织匀浆量>100mg时分装1ml/每EP管)
↓
颠倒混匀10下,室温5分钟
↓
加氯仿1/5体积(0.2ml)(必须按总体积的1/5)
↓
颠倒混匀10下,室温5分钟
↓
4℃,离心12000g,15分钟
↓
转上层水相(约400μl)于另一1.5mlEP管中
↓
加等体积异丙醇(约400μl),混匀室温10分钟
↓
4℃,离心12000g,10分钟
↓
弃上清
↓
加冰预冷的75%乙醇(用DEPC水配)1ml
↓
4℃离心7500g,5分钟
↓
弃上清,空气干燥5-10分钟(不能完全干燥)
↓
溶于DEPC水中至20μl(10μl-20μl)
(可在55-60℃水中,<10分钟助溶)
注:
1、RNA若用于核酸转移应溶解于样本缓冲液中,否则DEPC溶解
2、细胞组织加TRIzol匀浆后,可在-60℃放置至少一个月(甚至可一年以上)
3、RNA在75%乙醇中,2-8℃至少可保存一周,-20℃至少可保存一年
两步法RT-PCR
(第一步:逆转录反应)
试剂 浓度 体积 终浓度
RNA 23μl(11.5μl)
Oligo(dT)15 0.05μg/μl 4μl(2μl) 0.005μg/μl
(稀释10倍后用)
↓
混匀,离心,70℃ 5min
↓
立即冰水浴,稍离心
↓
试剂 浓度 体积 终浓度
M-MLV Buffer 5× 8μl (4μl) 1×
dNTP 10mM 2μl (1μl) 0.5mM
RNasin 40U/μl 1μl (0.5μl) 20μ
M-MLV 200U/μl 2μl (1μl) 200U
总体积40μl(20μl)
↓
混匀,离心,42℃ 60min
↓
95℃ 10min(破坏MLV)
↓
4℃保存
两步法RT-PCR
(第二步:PCR反应)
总体积20μl(50μl)
试剂 浓度 体积 终浓度
Taq Buffer 10× 2μl (5μl_) 1×
MgCl2 25mM 1.2μl (3μl) 1.5mM
dNTP 10mM 0.2μl (0.5μl) <200uM
上游引物 10pmol/μl 0.3μl (1μl) 10pmol
下游引物 10pmol/μl 0.3μl (1μl) 10pmol
cDNA模板 X (?) (1-10μl)
DEPC水 20μl-4.3μl-X
Taq酶 2.5U/μl 0.3μl (1μl) 2.5U/μl
↓
混匀
↓
97℃,5分钟
↓
立即冰水浴
↓
混匀
↓
95℃ 5分 预变性
94℃ 30秒 变性
X℃ 40秒 退火
72℃ 30秒 延伸
72℃ 7分 终末延伸
28-36循环,4℃保温
三、电泳:
加1-10μl PCR产物 溴芬兰(1-2.5μl)混匀,加样,电泳。
注意:Taq酶、M-MLV、Rnasin等-20℃保存,操作时置于冰上。DNTP勿反复冻融。
参考资料:http://tong.dxy.cn/experiment/430/457/459/21706.htm
PT-PCR操作流程
先将1-10μl左右PCR产物,加已点在纸上的溴酸兰,反复吸打混匀后进行电泳,一般电流为10mA,电源100V,电泳30分钟,紫外灯下观察,满意的结果扫描打印。九、几个注意点:1、逆转录的关键步骤是立即冰水浴?2、Rt时,先打开PCR预热30分钟。
GPCR抑制剂
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ptpcr原理
提高PCR反应的特异性和灵敏度。在PCR的基础上,采用两组引物进行两次扩增,以提高PCR反应的特异性和灵敏度。PT-PCR相对于常规PCR,可以避免非特异性扩增产物的出现,减少PCR反应的假阳性率,从而提高检测的精度和可靠性。它在分子诊断和基因检测等领域得到了广泛的应用。
ptpcr全称
反转录·聚合酶链反应。RTPCR全称是反转录·聚合酶链反应,英文全拼是reversetranscription-polymerasechainreaction,缩写成了RT-PCR,是将RNA的反转录(和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。
什么是PT-PCR?
应用逆转录PCR(PT-PCR)技术RT-PCR.RT-PCR 为反转录RCR和实时PCR的共同缩写.是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形.在RT-PCR中,一条RNA链被逆转录成为互补DNA,再以此为模板通过PCR进行DNA扩增.
ptpcr和pcr有什么区别
原理不同、应用不同。1、原理不同。ptpcr实时监测与DNA结合的荧光染料激发的荧光,普通OCR通过检测插入DNA中核算染料的量来测定PCR最终产物量。2、应用不同。ptpcr主要是用来定量分析和确定基因转录水平的,PCR仪是做定性分析和扩增基因片段,定量ptpcr仪可以做普通PCR仪的工作,反之不行。
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PT-PCR 免疫组化 Western blot的区别
应该是RT-PCR吧,即实时定量PCR,用于核酸水平的定量检测。免疫组化用于对目标蛋白进行组织中的位置测定,WB用于检测目标蛋白的量的检测,基本算半定量。
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