细菌的分子生物学鉴定要怎么做?
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发布时间：2022-05-22 01:47
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时间：2023-11-24 15:55
首先你要提出细菌的DNA。
方法如下：
1、液体培养及保种：从斜面上挑取菌苔于液体培养基中放摇床上震荡（转速160r/min）培养16小时。吸取菌液于1.5ml的经过灭菌的EP管中，再加甘油（30-40%）进行保种。（-80摄氏度保藏2年）
2、提取DNA（CTAB法）：
（1）取1.5ml菌液于1. 5ml离心管中，12000r/min离心2min，弃上清。
（2）向沉淀物中加入350ul双蒸水，重新悬浮沉淀。
（3）加入20ul10%SDS和3ul的蛋白酶K（20mg/ml），溶菌酶3ul，混匀，于50℃温育1h。
（4）加入50ul 5mol/L NaCl溶液，充分混匀，再加入50ul CTAB/NaCl溶液，混合后再65℃温育30min。
（6）冷却后加入等体积的酚(沉淀蛋白质)：氯仿：异戊醇（增强酚的作用）（25:24:1），小心上下颠倒混匀，12000r/min离心5min，将上清液转移到新的EP管，重复此步骤2-3次，直至分层界面无白色沉淀。
（7）加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），小心颠倒混匀，12000r/min离心5min将上清液转移到新的EP管。（纯化作用）
（8）加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，12000r/min离心15min弃上清。
（9）向离心管中加入75%乙醇，12000r/min离心5min洗涤DNA沉淀，小心弃上清，重复洗涤1次，弃上清将离心管倒置于吸水纸上，晾干。
（10）加入50ul（双蒸水）/ TE Buffer溶解DNA于4℃保存。
（11）电泳检测
6、PCR扩增：（细菌的通用引物为27F和1492R）将提取得到的DNA进行PCR扩增，电泳检测扩增得到的16S rDNA（如果菌类分明，条带清晰，PCR原液可直接送去测序，双向测通，得到测序序列后到NCBI的BLAST页面比对，得出鉴定结果）
7、酶切带型分型确定操作单元：将扩增产物用HhaI和HaeIII两种*性内切酶进行酶切，电泳检测酶切产物，酶切带型相同的分为一个操作单元。
8、连接转化：从每一个操作单元中选取一株菌的16S rDNA进行连接实验。将连接产物转入感受态细胞中，将感受态细胞涂布于含有Amp的平板上，倒置培养12-16h。
9、克隆子挑选及PCR鉴定：从上一步的平板上挑取单菌落于含有Amp的液体培养基中震荡培养12h，以培养液为模板直接进行PCR扩增鉴定（1000-2000bp）。将含有目的片段的克隆子菌液低温保存。
10、测序：将含有目的片段的克隆子菌液送去测序。
11、序列拼接：运用DNAMAN软件对测序得到的序列进行拼接。
12、建树：对拼接得到的序列用Blast进行比对，最后将比对得到的所有序列运用MEGA6建立系统发育树。
