两个生化问题，急，线上等。1，比较脂肪酸合成和分解的异同 2，简述三大分子杂交技术的应用
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发布时间：2022-04-26 18:42
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时间：2023-10-21 15:08
2....核酸分子杂交法
这是最早用于性病诊断的重组DNA技术。基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下（适宜的温度及离子强度等）可按碱基互补原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。杂交的双方是待测核酸及探针。待测核酸序列为性病病原体基因组或质粒DNA。探针以放射核素或非放射性核素标记，以利于杂交信号的检测。
所谓杂交（hydridization）指两个以上的分子因具有相近的化学结构和性质而在适宜的条件下形成杂交体（hybrid），杂交体中的分子不是来自一个二聚体分子。同一个二聚体中的两个分子在变性解离后重组合称为复性。利用两条不同来源的多核苷酸链之间的互补性而使它们形成杂交体双链叫核酸杂交。与核酸杂交技术相对应的另一项技术被称为探针技术，它是指利用标记分子对其它分子的识别性而实现对后者进行检测的一种技术，我们把标记的分子叫探针（Probe）。将探针技术与分子杂交技术相结合，从而使分子杂交技术得以广泛推广应用。目前所用的核酸杂交技术均应用了标记技术。
（一）DNA的变性 DNA变性是指双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成无规则线团，称为DNA变性。加热、改变DNA溶液中的pH，或有机溶剂等理化因素的影响，均可使DNA变性。变性的DNA粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加。
（二）DNA复性 变性DNA只要消除变性条件，二条互补链还可以重新结合，恢复原来的双螺旋结构，这一过程称为复性。复性后的DNA，理化性质都能得到恢复。 核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价健的形成即出现稳定的双链区，这是核酸分子杂交的基础。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序就可以形成杂交双链。分子杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与DNA的二条单链之间，由于DNA一般都以双链形式存在，因此在进行分子杂交时，应先将双链DNA分子解聚成为单链，这一过程称为变性，一般通过加热或提高pH值来实现。使单链聚合成双链过程称为退火或复性。用分子杂交进行定性或定量分析的最有效方法是将一种核酸单链用同位素标记成为探针，再与另一种核酸单链进行分子杂交。
（三）探针——靶分子反应 从化学和生物学意义上理解，探针是一种分子，它带有供反应后检测的合适标记物，并与特异靶分子反应。抗体——抗体、外源凝集素——碳水化合物、亲合素——生物素、受体——配基（Ligand）以及互补核酸间的杂交均属于探针——靶分子反应，蛋白质探针（如抗体）与特异靶分子是通过混合力（疏水离子和氢键）的作用在少数特异位点上的结合，而核酸探针与互补链的反应则是根据杂交体的长短不同，通过氢键几十、几百甚至上千个位点上的结合。这就决定它的特异性。 基因探针根据标记方法不同可粗分为放射性探针和非放射性探针两大类，根据探针的核酸性质不同又可分为DNA探针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针及寡核苷酸探针等几类。DNA探针还有单链和双链之分。
下面分别介绍这几种探针。
一、核酸探针的种类
（一）DNA探针 DNA探针是最常用的核酸探针，指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针。现已获的DNA探针种类很多，有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针，这类探针多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。这些DN*段须是特异的，如细菌的毒力因子基因探针和人类ALU探针，这些DNA探针的获得有赖于分子克隆技术的发展和应用。以细菌为例，目前分子杂交技术用于细菌的分类和菌种鉴定比用G+C百分比值要准确的多，是细菌分类学的一个发展方向，加之分子杂交技术的高度敏感性，分子杂交在临床性病病原体诊断上具有广泛的前景。 DNA探针（包括cDNA探针）有三大优点：第一，这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。其次，DNA探针不易降解（相对RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。第三，DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移法、随机引物法、PCR标记法等，能用于同位素和非同位素标记。
（二）cDNA探针 cDNA是指互补于mRNA的DNA分子（complementary DNA）。cDNA是由RNA经一种称为逆转录酶的DNA聚合酶催化产生的。携带逆转录酶的病毒侵入宿主细胞后，病毒RNA在逆转录酶的催化下转化成双链cDNA，并进而整合入宿主细胞染色体DNA分子，随宿主细胞DNA复制同时复制，这种整合的病毒基因组称为原病毒。在静止状态下，可被复制多代，但不被表达，故无毒性，一旦因某种因素刺激而被活化，则该病毒大量复制。如其带有癌基因，还可能诱发细胞癌变。 逆转录现在已成为一项重要的分子生物学技术，广泛用于基因的克隆和表达。从逆转录病毒中提取的逆转录酶也已商品化。最常用的有AMV逆转录酶。利用真核mRNA3′末端存在一段聚腺苷酸尾，可以合成一段寡聚胸苷酸用作引物，在逆转录酶催化下合成互补于mRNA的cDNA链，然后再用RNase H将mRNA消化掉，再加入大肠杆菌DNA聚合酶I催化合成另一条DNA链，即完成了从mRNA到双链DNA的逆转录过程。 所得到的双链cDNA分子经S1核酸酶切平两端后接一个有*酶切点的接头(Adapter),再经特定*酶消化产生粘性末端，即可与含互补末端的载体进行连接。常用的克隆载体是λ噬菌体DNA，如λgt、EMBL和Charon 系列等。用这类载体可以得到包含105以上转化子文库，再经前面介绍的筛选方法筛选特定基因克隆。用这种技术获得的DNA探针不含有内含子序列。因此尤其适用于基因表达的检测。
（三）RNA探针 RNA探针是一类很有前途的核酸探针，由于RNA是单链分子，所以它与靶序列的杂交反应效率极高。早期采用的RNA探针是细胞mRNA探针和病毒RNA探针，这些RNA是在细胞基因转录或病毒复制过程中得到标记的，标记效率往往不高，且受多种因素的制约。这类RNA探针主要用于研究目的，而不是用于检测。例如，在筛选逆转录病毒人类免疫缺陷病毒（HIV）的基因组DNA克隆时，因无DNA探针可利用，获得HIV的全套标记mRNA作为探针，成功地筛选到多株HIV基因组DNA克隆。 随着体外逆转录技术不断完善，已成功的建立了单向和双向体外转录系统。该系统主要基于一类新型载体PSP和PGEM，这类载体在多克隆位点两侧分别带有SP6启动子和T7启动子，在SP6RNA聚合酶或T7RNA聚合酶作用下可进行RNA转录。如果在多克隆位点接头中插入了外源DN*段，则可以以DNA两条链中的一条为模板转录生成RNA。这种体外转录反应效率很高，在1小时内可合成近10μg的RNA产物。只要在底物中加入适量的放射性或生物素标记的dUTP，则所合成的RNA可得高效标记。该方法能有效地控制探针的长度并可提高标记分子的利用率。 RNA探针和cDNA探针具有DNA探针所不能比拟的高杂交效率，但RNA探针也存在易于降解和标记方法复杂等缺点。
（四）寡核苷酸探针 前述三种探针均是可克隆的，一般情况下，只要有克隆的探针，就不用寡核苷酸探针。在DNA序列未知而必须首先进行克隆以便绘制酶谱和测序时，也常应用克隆探针。克隆探针一般较寡核苷酸探针的特异性强，复杂度也高，从统计学角度而言，较长的序列随机碰撞互补序列的机会较短序列少。克隆探针的另一优点是，可获得较强的杂交信号，因为克隆探针较寡核苷酸探针掺入的可检测标记基因更多。但是，较长的探针对于靶序列变异的识别能力又有所降低。对于仅是单个碱基或少数碱基不配的两个序列，克隆探针不能区分，往往杂交信号相当。这既是其优点，又是其缺点，优点是当用于检测病原微生物时，不会因病毒或细菌DNA的少许变异而漏诊，缺点则是不能用于检测突变点。这种情况，通常要采用化学合成的寡核苷酸探针。
合成的寡核苷酸探针具有以下特点：
第一，由于链短，其序列复杂度低，分子量小，所以和等量靶位点完全杂交的时间比克隆探针短。
第二，寡核苷酸探针可识别靶序列内一个碱基的变化，因为短探针中碱基错配能大幅度降低杂交体的Tm值。
第三，一次可大量合成寡核苷酸探针，使得这种探针价格低廉，与克隆探针一样，寡核苷酸探针能够用酶学或化学方法修饰以进行非放射性标记物的标记。最常用的寡核苷酸探针长18—40个碱基，目前的合成可有效地合成至少50个碱基的探针。
对于合成的寡核苷酸探针有以下要求：
（1）长度以18-50碱基为宜，较长探针杂交时间较长，合成量也低；较短探针特异性较差。
（2）碱基成分：G+C含量为40%-60%，超出此范围则会增加非特异杂交。
（3）探针分子内不应存在互补区，否则会出现抑制探针杂交的“发夹”状结构。
（4）避免单一碱基的重复出现。
（5）一旦选定某一序列符合上述标准，最好将该序列与核酸库中的核酸序列比较，探针序列应与靶序列核酸杂交，而与非靶区域的同源性不应超过70%或有连续8个或更多的碱基的同源。否则，该探针不能用。
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时间：2023-10-21 15:08
