pcrmix被污染了怎么办
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发布时间：2022-04-26 16:49
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热心网友
时间：2022-05-07 01:32
首先，要辨别PCR污染的来源，是环境污染，还是PCR反应液的污染？
设立阴阳性对照，有利于检测反应体系各成分的污染情况。尤其是设立空白对照，这对检测试剂中PCR产物残留污染是非常有益的。
在排除试剂污染的可能性，并更换试剂后，若不久又发现试剂被污染了，则考虑可能为环境污染。环境污染的最主要原因是DNA溶液的溅出和DNA气溶胶造成的实验区域的污染，这在PCR产物扩增区尤其容易出现。移液器*头和EP管架是比较常见的污染部位。
如果是环境污染，还可对每个区域进行涂抹采样和核酸提取，以最终鉴定污染的区域所在。
对PCR的环境污染，有如下几种治理方法：
1、用常规消毒液定期在环境中喷雾消毒处理。
2、 稀酸处理法：对可疑器具用1mol/L盐酸擦拭或浸泡，使残余DNA脱嘌呤；此方法缺点是盐酸对皮肤有一定的腐蚀性。
3、紫外照射法：紫外波长一般选择254—300nm，照射30分钟至2小时。但需要注意的是，UV照射仅对500bp以上长片段有效，对短片段效果不大。
4、 选用商品化的DNA污染祛除剂。推荐Minerva公司的PCR CleanTM 喷雾剂、湿巾。其1分钟即起效，方便快捷，效果显著，可同时去除DNA和RNA。作用1分钟后，用纸巾擦拭，即可完成对DNA污染的清除。
对于PCR反应液的污染，可采取以下方法：
1、 DNase I法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5U DNase I，室温条件下反应30min后加热灭活，然后加入模板和Taq聚合酶进行正常PCR扩增。
2、 内切酶法：选择识别4个碱基的内切酶（如MspI和Taq I等），可同时选择几种，以克服用一种酶只能识别特定序列的缺陷，室温作用1h后加热灭活再进行PCR试验。
3、紫外照射法：对未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液进行紫外照射，注意事项与方法同上述UV照射法。
4、 尿嘧啶糖苷酶（UNG）法：用dUTP代替dTTP，使PCR产物中掺入大量dU。再次进行PCR扩增前，用UNG处理PCR混合液即可消除PCR产物的残留污染。由于UNG在PCR循环中的变性一步便可被灭活，因此不会影响含dU的新的PCR产物。
热心网友
时间：2022-05-07 02:50
一个好的PCR实验室，必须要时刻注意污染的监测，考虑是否受到污染，如有污染，是何原因造成的。通过有效地监测，采取正确的相应措施，防止或消除污染。
1、阴性对照：阴性对照是每次PCR实验都必须做的。它包括了标本对照与试剂对照，通过对照确认样本和试剂是否受到感染。
2、阳性对照：它是PCR 反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。阳性对照要选择扩增度中等、重复性好、经鉴定是该产物的标本。但阳性对照其对检测或扩增样品污染的可能性很大。因而当某一PCR试剂已经使用稳定，检验人员完全掌握时，在之后的实验中应尽可能免设阳性对照。来减小污染概率。
4、重复性试验。
二、防止污染的方法
1、合理分隔实验室：将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增以及PCR产物的鉴定等步骤进行分区或者分室，尤其要将样本处理和PCR产物的鉴定与其它步骤严格分开。 理想的分区为，标本处理区、PCR反应液制备区、PCR循环扩增区、PCR产物鉴定区。
2、PCR试剂要做好预混合分装：所有的PCR试剂都应进行小量分装，PCR反应液应尽可能预先配置好，然后再小量分装，在-20℃下保存，以减少重复加样次数，从而避免污染机会。另外，PCR试剂、PCR反应液应当与样品及PCR产物分开保存，不可放于同一冰盒或冰箱。
3、吸样*污染防护：吸样*是一个非常容易发生污染的设备。如操作时不慎将样品或模板核酸吸入*内或粘在*头上，将会成为一个严重的污染源，因而使用吸样*时要格外小心，吸样要慢，并尽量一次性完成，忌多次抽吸，避免发生交叉污染或气溶胶污染。
4、减少PCR循环次数：以PCR产物达到检测水平为宜。
5、防止操作人员污染：使用一次性手套、吸头、小离心管。
