RT-PCR的引物如何设计？20

发布网友发布时间：2023-09-19 10:11

共4个回答

热心网友时间：2024-11-16 00:53

引物可以通过一些软件设计，比如primer 5 ，但是还需要注意一些细节问题。
比如
1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。
2.引物长度一般在15~30碱基之间。引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。
3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。 GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

热心网友时间：2024-11-16 00:53

先找出你要扩增的“保守序列”的所有碱基，到专门的设计软件上搜索最佳引物序列。
软件和软件的使用在丁香园上均可找到。
http://www.dxy.cn/bbs
不过一开始最好有设计过的人在身边指点，不然会有很多问题

热心网友时间：2024-11-16 00:54

建议你去借分子克隆实验指南来看看，或者采用引物设计软件，比如primer premier 5，把序列输入就可以得到不同打分的引物对

热心网友时间：2024-11-16 00:54

http://www.bbioo.com/bio101/2007/20171.htm

上面有很清楚的设计方法。