如何避免荧光定量pcr检测技术的实验误差
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发布时间：2022-04-24 06:58
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热心网友
时间：2022-06-17 06:00
避免荧光定量pcr检测技术的实验误差的方法如下：
样品的处理及选取
处理样品时，必须确保样品都得到了充分的处理。选取实验样品时，要保证选取的组织尽可能的纯，不要污染其他组织，样品选好后，即可放入液氮或超低温冰箱保存。
核酸提取
加入液氮研磨要彻底，蛋白、多糖、多酚类物质要去除干净，确保得到高质量的核酸，分光光度计检测核酸质量，RNA OD260/280=2.0左右，DNA OD260/280=1.8左右，最好再做电泳检测；同一样品要提取2到3个RNA，所剩余的样品不要丢弃，继续低温保存。
得到的RNA立即反转录为cDNA，RNA样品最好不要存放。
对于精度要求较高的定量PCR，最好先在样品的所有组织类型内做内参基因的稳定性分析，找到表达恒定基因作为内参。
做定量PCR时，先把除模板外的所有试剂预混，然后分装到PCR管中，分装时尽量采用排*，加样时尽量采用排*。
体系中最好参入ROX参比荧光，消除光程差和加样的偏差。
重复操作
让重复操作最大的修正偏差。最有意义的重复是提取样品RNA时就重复，同一个样品，分别提取3份RNA，3份RNA都做反转录，所得的3份cDNA都做定量PCR检测，这样的重复之所以最有意义是因为我们把RNA提取、反转录、上机检测三步做了重复，这样得出的平均值要比只在上机检测时对同一cDNA样品做三个重复要有意义的多。
同一个cDNA样品做三个重复定量检测求平均值主要是消除加样时的误差，排*加样时，误差很小，加样时的误差可以通过设几个重复检测出来。
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时间：2022-06-17 06:00
