western blot详细步骤
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发布时间：2023-09-03 19:57
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时间：2024-08-05 04:14
western blot详细步骤如下：
一、蛋白样品制备（组织中总蛋白的提取）
第一步：
1、敲取0.07-0.1g组织+400-500ul裂解液，放入打样管，放入打样机打样。
2、实验室研钵研磨：取稍大于0.1g的样品放入研钵中，来回磨，至粉末状，用*头刮取收集入离心管。
第二步：取出的样品放置冰上1-2h（中间混匀5-6次）直至裂解完全。
第三步：样品离心*2，取上清于新的EP管中。
二、蛋白含量的测定
第一步：在96孔板第一列1-8分别为浓度为0,1,2,4,6,8,9,10倍的蛋白标准液+水=10或20ml，再加上5倍稀释的考马斯亮蓝染液200ml。
第二步：在96孔板后面几列依次加入稀释的蛋白样品或原液10-20ml以及5倍稀释的考马斯亮蓝染液200ml。
三、电泳
第一步：清洗玻璃板
第二步：配胶
1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧,然后垂直卡在架子上准备灌胶。
2、配分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。待胶面升到玻璃板3/4位置时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。
3、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。配浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
4、用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。
第三步：上样
1、测完蛋白含量后，计算含50mg蛋白的溶液体积即为上样量。适量蛋白加入4：1 5*Loading Buffer于离心管，100℃水中煮5min使蛋白变性。放置冰上3min，离心15min，13000rpm，4℃。
2、加足够的1*电泳缓冲液后开始准备上样。用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。
第四步：电泳
浓缩胶80V电压跑20分钟，可多跑几分钟；分离胶180V电压跑至底端。
第五步：停止电泳
纯水冲洗玻璃板，取胶，清洗切去浓缩胶，在Marker下方切角做标记，将胶泡在清水中。
四、转膜
第一步：剪PVDF膜，并提前切个角，甲醇中泡2-3min。
第二步：将膜、海绵、滤纸一起泡入1*转膜液中，放4℃保存。
第三步：将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。在垫子上垫2层滤纸，一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。将胶盖于滤纸上，轻轻用玻棒擀去气泡。
将膜用镊子盖于胶上，并除气泡。在膜上盖2层滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，合起夹子。整个操作在1*转膜液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。
第四步：将夹子放入转膜槽槽中，黑对黑,对红。电转移时会产热，过热有可能造成蛋白质的降解，同时大量产热，会使凝胶膨胀，有可能在胶和膜之间产生空隙，引起转膜不均匀，所以在转膜槽中放入冰盒，在冰水混合物中进行转膜。
第五步：转完后将膜放入装水的小盒中冲洗，倒水后，加5%的封闭液，摇床封闭1h。
五、抗体孵育,免疫反应
第一步：回收封闭液,加入一抗,摇床30min-1h，4℃过夜,再孵育30min-1h。
第二步：一抗回收，用PBST洗，洗5次，每次5min。（少时多次）
第三步：加二抗，孵育2h。
第四步：二抗回收，用PBST洗，洗5次，每次5min。（少时多次）
第五步：纯水冲洗5-7次，倒掉纯水，加化学发光，膜在化学发光中浸泡2-3min，成像。
western blot介绍
一、western blot含义
免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（Western blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。
由于免疫印迹具有 SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。结合化学发光检测，可以同时比较多个样品同种蛋白的表达量差异。
二、western blot基本原理
将混合抗原样品在凝胶板上进行单向或双向电泳分离, 然后取固定化基质膜与凝胶相贴。
在印迹纸的自然吸附力、电场力或其它外力作用下, 使凝胶中的单一抗原组份转移到印迹纸上, 并且固相化。最后应用免疫覆盖液技术如免疫同位素探针或免疫酶探针等, 对抗原固定化基质膜进行检测和分析。
三、western blot优点
1、 湿的固定化基质膜柔韧，易于操作。
2 、固定化的生物大分子可均一的与各种免疫探针接近，不会象凝胶那样受孔径阻隔。
3、 免疫印迹分析只需少量试剂。
4、 孵育、洗涤的时间明显减短。
5、可同时制作多个拷贝，用于多种分析和鉴定。
6、结果以图谱形式可长期保存。
7、 免疫探针可通过降低PH值等方法，象抹去录音磁带一样将探针抹掉。再换用第二探针进行分析检测。免疫印迹法的应用范围及优点不仅局限于此，它必将随着这一方法的深入研究而不断发展和完善。
