westernblot的原理及操作步骤,应用有哪些
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发布时间：2022-04-25 15:37
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热心网友
时间：2023-11-01 16:00
Western Blot与Southern印迹杂交或Northern印迹杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗.经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体（例如*纤维素膜NC膜）上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变.以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分.该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达.
分类
Western Blot显色的方法主要有以下几种：i.放射自显影 ii.底物化学发光ECL iii.底物荧光ECF iv.底物DAB呈色 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色,体同水平和实验条件的是用第一种方法,目前发表文章通常是用底物化学发光ECL.只要买现成的试剂盒就行,操作也比较简单,原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺,如遇到HRP,即发光,可使胶片曝光,就可洗出条带.
其他
值得一提的是,western blot 这个名称的由来很有意思.最开始做印迹工作的是一个叫做Southern的科学家,但印迹的对象是DNA链,他把这种技术称为Southern blot,后来类似的出现了两个过程相似,但是对象不同的印迹方法,一个针对RNA,一个对蛋白质,人们分别把这两种技术的称为Northern和Western,与这两个技术的发明人没有关系了.
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时间：2023-11-01 16:00
Western
Blot与Southern印迹杂交或Northern杂交方法类似，但Western
Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如*纤维素膜NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
操作步骤
（一）蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min。然后4℃，13,000g离心15min。取上清液作为样品。
（二）电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。
（三）转移：（半干式转移）
1、电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min×3次。
2、膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中10min。
3、转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸干。接通电源,恒流1mA/cm2，转移1.5hr。转移结束后，断开电源将膜取出,割取待测膜条做免疫印迹。
