求助:感受态细胞在反复冻融后还能不能用
发布网友
发布时间：2022-04-25 21:59
我来回答
共2个回答
热心网友
时间：2022-05-05 01:32
方法一：细菌转化的方法多以Mendel和Higa（1970）的发现为基础，其基本方法是用冰预冷的CaCl2或多种2价阳离子等处理细菌，使之进入感受态得以转化。用CaCl2制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞，常用于成批制备感受态细菌。本法适用于大多数大肠杆菌菌株，且迅速、重复性好。操作过程简述如下。1．从37℃培养16～20h的新鲜平板中挑取一个单菌落（如大肠杆菌DH52），或1ml新鲜的16～20h过夜培养物，转到一个含有100mlLB培养基的1L或500ml烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养约2～3h（旋转摇床200～300r/min），每隔20～30min测量OD600值≈0.4。2．在无菌条件下将细菌转移到一个，用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中，在冰上放置10～20min。3．于4℃用SorvallGS2转头（或与其离心管相配的转头）以4000r/min离心10min，以回收细胞。4．倒数培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。5．以10ml用冰预冷的0.1mMCaCl2重悬每份沉淀，放于冰上。6．于4℃用SorvallGS3转头（或与其相应的转头）以4000r/min离心10min，以回收细胞。7．倒出培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。8．每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1MCaCl2重悬每份沉定，此时，可以迅速将细胞分装成小份，液氮中冰冻，-70℃贮存备用。9．用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，每管加DNA或连接反应混合物（体积≤10μl，DNA≤50ng），轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30min。10．将离心管放到预加温到40℃的循环水浴中的试管架上，放置90s～2min，不要摇动试管。11．快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min。12．每离心管加800μlSOC培养基，用水浴将培养基加温到37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45min使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。13．将适当体积（每个90mm平板可达200μl）已转化的感受态细胞转移到含200mmol/lMgSO4和相应抗生素的SOB培养基上。14．将平板置于室温至液体被吸收。15．倒置平皿，于37℃培养，12～16h后可出现菌落。方法二：CASsuperOne-StepCompetentCellPrepsKit采用一种简单便捷的方法处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，便于质粒DNA的转化，可满足一般实验的要求。与CaCl2法相比具有多种优点：使用方便，只需一步即可完成感受态细胞的制备；转化效率略高于CaCl2法，一般可达106-108cfu/μg，满足一般实验需要；感受态细胞制成后即可保存于-70℃,无须加入甘油，并且经长期保存活力无明显下降。准备工作：1．从液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌冻存菌，在LB平板上划线，37度过夜至长出单菌落。挑形态饱满的单菌落2个，分别接种5mlLB培养基中，37℃，250rpm，过夜培养。2．次日从5mlLB培养物吸取200μl转入50mlLB培养基中（250ml锥形瓶），37℃，250rpm培养2小时，此时OD600约0.4—0.5。感受态细胞的制备：3．吸取1ml菌液到1.5ml离心管里，5000rpm离心5分钟，弃去上清。4．加入100μl预冷的SolutionA，悬浮菌体，冰浴30分钟。5．此时感受态细胞已经制成可立即使用或-70℃保存。细胞转化：6．在感受态细胞中加入100pg-10ngDNA，混匀，冰浴30分钟，然后42℃1分钟热击，再次冰浴2分钟。加入0.9mlLB培养基，20μlSolutionB，37℃，振荡培养1小时。7．取适当菌液（100-200μl）涂布相应抗性的平板。8．过夜培养约16个小时，数菌落数，计算转化率。补充说明：1．所用器具一定要清洁；2．操作步骤2中培养基的装量也是很重要的，建议装量不要高于此值：500ml锥形瓶装100ml培养基，250ml锥形瓶装50ml培养基；3．在收获菌体前半小时还可以在培养基中加入20mM的MgCl2，效果会更好一些；4．为保证细胞处于对数生长期，培养后的菌体的OD值不要高于0.6；5．制备感受态细胞时所有操作尽量保证在冰上操作；6．细胞转化操作步骤6中也可以不必进行热击，冰浴后直接加入新鲜LB，简化操作步骤，但转化效率低于热击方法，适用于对转化率要求不高的实验。方法三：1、取1%大肠杆菌E.coli接种于含2mlLB培养基的试管中，37℃振荡培养过夜2、取0.1ml过夜培养物转种于含10mlLB培养基的三角瓶中，37℃振荡培养3h至OD600=0.3ml离心管中，冰浴10min。4、在4℃下以4000rpm离心5min，去上清液5、把菌体悬浮于15m1冰冷的0.1MCaCl2溶液中，置冰上30min6、然后再在4℃下以4000rpm离心10min，去上清液7、将菌体悬浮于0.1mlCaCl2溶液中，冰浴放置4-12hr备用。方法四：（1）将1ml过夜培养的细菌（如DH52、TG1、TM101）接种于100ml2×YT培养于500ml烧瓶。于37℃刷烈振荡，通常≥200rpm培养的细菌密度约OD550=0.2～0.5(5×107cells/ml),需2～4h。（2）将培养物放于冰上致冷10min，于4℃离心细菌培养物，10000rpm离心10min。（3）弃除上清，将细菌悬浮于原始培养体积的一半（约50ml）的50mMCaCl2和10mmTris·HCl（pH8.0）无菌冷冻液体中。（4）将细菌悬浮放在冰上约5min，然后将悬浮物于4℃10000/rpm离心10min。（5）弃上清，悬浮细菌于原始培养体积的1/15的50mMCaCl和10mMTris·HCl（pH8.0）无菌冷冻中。此时的细胞是感受态细胞，即可用于转化。200μl分装于无菌的1.5ml微量离心管中，贮存于-80℃冰箱中。方法五：TSB法（也是本人热衷的方法）1.药品制备1MMg2+(1MMgSO4和1MMgCl2等体积混合)，用0.22um滤膜超滤除菌。TSB液（30mL/80mL菌液）（现配现用）：PEG33503gTryptone0.3gYeastextract0.15gNaCl0.3g2.步骤：（1）活化菌株（2）挑单菌落培养于5mL的液笨培养基中（3）取液体培养物50uL于80mL的液体培养基中进行扩大培养（4）370C培养3－4小时，OD600在0.4－0.6（5）离心，去上清（6）加入20mLTSB，重悬（7）离心，去上清（8）加入10mLTSB，再加入15－20%的甘油，分装保存注，整个操作过程均应在冰上进行。所用药品均需灭菌。转化程序（1）取出200μl感受态细胞慢慢使其溶化，并立即放于冰上，加入DNA或连接反应混合物，DNA量通常≤50mg。用手指弹打试管10次，使之混匀，然后放在冰上40～45min。（2）将管放于42℃水浴中2min。（3）然后每管直接加入1.0ml2×YT培养基，倒置混匀，并于37℃培养8～12h，干浴或水浴，不需振摇。此期间使细菌生长并开始表达抗菌素。（4）每200μl转化混合物分别于6个2×YT琼脂培养板上补充相应抗生素，并含有X-gal（20mg/ml）、IPTG（200mg/ml）。
热心网友
时间：2022-05-05 02:50
储存：-70 ℃ 保存，避免反复冻融
