无缝克隆失败的原因
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发布时间：2022-04-25 23:01
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时间：2023-10-16 22:21
无缝克隆失败可能的原因:引物序列不正确 解决方案:确认引物序列含有15 bp与载体插入区域完全一致的同源序列。
另外有可能是因为PCR产物不纯 解决方案:优化PCR扩增反应以得到单一PCR产物;换一种纯化方法,纯化您的PCR产物。还有可能是因为反应体系中DNA浓度太低 解决方案:在重组反应中,加入推荐的DNA量，导致不纯的载体或插入片段抑制重组反应 解决方案:推荐采用胶回收或离心柱法纯化DNA后进行重组反应。
可在PCR反应之前先将模板质粒线性化；PCR产物用DpnI处理，消化模板质粒，然后再纯化，可能的原因：转化用平板放置时间过长导致抗性失效。
可以选择优化PCR扩增体系，提高特异性或胶回收纯化目的片段，确认平板新鲜配置，并含有正确、适量的抗生素，然后可在PCR反应之前先将模板质粒线性化，PCR产物用DpnI处理，消化模板质粒，然后再纯化。
