旋毛虫病的几种诊断方法及比较
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发布时间:2023-07-10 12:14
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时间:2024-10-03 22:31
旋毛虫病是一种严重的人畜共患疾病,是英国人Peacock于1828年首次在人体中发现并由Owen(1835)命名为旋毛线形虫。我国于1965年在*地区发现首例人体旋毛虫病。旋毛虫病研究的重点在于诊断方法。
旋毛虫病的诊断主要分为病原学诊断方法和免疫学诊断方法。病原学诊断主要都是采用活检方式,漏检率较高,并且会造成创伤,效果不好。而免疫学诊断灵敏度高,已经广泛被利用于人体旋毛虫病血清流行病学的调查。本文主要介绍间接荧光抗体试验(1FAT)、免疫酶染色试验(1EST)和酶联免疫吸附试验(ELISA)等免疫学诊断方法。
1诊断方法
1.1间接荧光抗体试验(IFAT)
1.1.1感染肌肉组织抗原片的制备取感染旋毛虫病猪的膈肌作材料,经10%中性*固定,常规石蜡包埋切片,切片厚度5~10微米,明胶-钾明矾溶液作粘片粘附剂。每张载玻片排放2~4块切片。烘干后常规脱蜡,用0.01摩尔pH7.4PBS洗3次后切片,分别经过氧化氢-甲醇溶液及1∶20倍稀释的正常兔血清37℃各处理20分钟,如上用PBS洗后用滤纸条吸干水分或自然干燥即为诊断用抗原片,置4℃冰箱保存备用。
1.1.2荧光抗体的制备
1.1.2.1兔抗猪IgG的制备健康猪血清经饱和硫酸铵盐析,Sephadex~G25脱盐后用DEAE纤维素纯化。用纯化后的猪IgG免疫家兔制得兔抗猪血清后,再按提纯猪IgG的方法提纯兔抗猪IgG。
1.1.2.2抗体的标记精取异硫氰酸荧光素(FITC)3毫克,加入0.5摩尔/升碳酸钠溶液0.3毫升,使FITC充分溶解。取10毫克/毫升的兔抗猪IgG6毫升,在室温下逐滴加入FITC溶液,边加边搅拌,加完后,室温下继续搅拌3小时。
1.1.2.3荧光抗体的纯化及质量鉴定将标记后的荧光抗体溶液在4℃下用0.01摩尔pH7.4PBS透析4~5天,直到再无荧光色素透出为止。经过透析的荧光抗体再经Sephadex-G25层析。用紫外分光光度计分别测495纳米及280纳米处的密度值后算得标记的荧光抗体F/P值为2。
1.1.3测试方法及结果判定抗原片滴加含20%正常兔血清及1%牛血清白蛋白的PBS,37℃孵育20分钟;用PBS冲洗后滴加用含5%正常兔血清的PBS作1∶100稀释的待检血清,37℃孵育45分钟;PBS冲洗后再滴加1∶10倍稀释的荧光抗体溶液,37℃孵育45分钟。PBS冲洗后滴加无荧光甘油缓冲液置荧光显微镜下检查,以切片中肌幼虫切面出现黄绿色荧光者判为阳性。
每批试验应设阳性、阴性参考血清对照和猪正常肌组织切片对照。
1.2免疫酶染色试验(IEST)
1.2.1待检血清实验室感染8周旋毛虫豚鼠血清35份。
1.2.2抗原的制备剖杀经人工感染旋毛虫幼虫2个月的大白鼠,取膈肠肌及后腿内侧肌肉,镜下压片每个视野平均7条幼虫,用磷酸缓冲液冲洗后,用冰冻切片机切成6微米厚的幼虫冰冻切片,每张载玻片裱贴5块组织片,经丙酮固定后;即为IEST抗原片,保存-20℃备用。
1.2.3操作步骤在旋毛虫幼虫冰冻切片上,将测试血清用0.01摩尔/升pH7.4~7.6PBS(含0.05%吐温~20)稀释成5,10,20,40,80,160比例的浓度(起始浓度为血清原液),分别滴于切片上,每次试验设阴性血清对照。置湿盒中,35℃孵育60分钟,用0.01摩尔/升pH7.4~7.6PBS洗涤3次,每次5分钟,吹干,滴加酶标葡萄球菌蛋白A(HRP~SPA),同上孵育洗涤,滴加底物溶液(3′3-二氨基联苯胺四盐酸盐-过氧化氢),室温反应15~20分钟,弃底物,用蒸馏水速洗,趁湿片在普通光学镜下观察反应结果。
1.2.4结果判断根据感染大鼠肌肉切片上的幼虫切面显色的深浅,记录结果。反应不着色(-),反应呈现淡棕色(+)、棕色(++)、棕褐色(+++)。若待检血清lEST滴度≥1∶10(+)时,即为lEST阳性。
1.3酶联免疫吸附试验(ELISA)
酶联免疫吸附试验按非均相测定法可分为10种类型,但常用的有4种:直接型、间接型、双抗体夹心型、固相抗体竞争型。本文主要介绍间接型(常规ELISA试剂盒法)。
1.3.1试剂盒准备根据情况选用合适的ELISA试剂盒。
1.3.2检样的准备在受检猪耳静脉采血2滴,滴于1厘米×2厘米的滤纸片上,将其浸泡于0.01摩尔/升pH7.4PBS(含0.05%吐温-20)2毫升,37℃2小时或4℃过夜,备用。阴阳性血清作1∶200稀释,被检血清作1∶100稀释。
1.3.3操作方法与结果判断
1.3.3.1加样于诊断盒每孔加检样100微升,室温(25℃)静置2分钟。
1.3.3.2反应甩去被检液,每孔加1号试液1滴(40微升),室温静置2分钟。
1.3.3.3洗涤甩去1号试液,每孔加2号试液1滴(40微升),立即用蒸馏水或自来水反复冲洗5次以上。
1.3.3.4显色拍干反应板上的残液,每孔先加3号试液1滴,再加4号试液1滴,轻轻混匀,室温静置2~3分钟。
1.3.3.5判定在白色背景下,兰色为阳性,吸收度≥0.3,无色为阴性,吸收度≤0.1。
2比较
间接荧光抗体试验(IFAT)、免疫酶染色试验(IEST)、酶联免疫吸附试验(ELISA)是旋毛虫病当前诊断常用的免疫学方法。
间接荧光抗体试验(IFAT)较早用于诊断旋毛虫病,优点是制备的荧光标记抗体,可以用于多种抗原、抗体系统的检测。初期用全虫作抗原,用试管法检测后发展为用虫体或带虫肌肉切片作抗原。崔晶等应用旋毛虫幼虫冰冻切片抗原,以IFAT检测216份旋毛虫病人血清,抗体阳性率为90.74%,发病后第1周抗体阳性率70.59%,第2周升至91.30%,有显著差异(P<0.025),至第3、4周分别达95.83%和100%。旋毛虫幼虫抗原片在-20℃至少可保存2.5年而不失活。
免疫酶染色试验(IEST)与ELISA的原理基本相似。陈雅棠等用人工感染旋毛虫大鼠肌肉的冰冻切片作为抗原,用1EST检测待检血清,在11例肌肉活检证实有旋毛虫感染的病人中,阳性率为81.8%,与正常对照组和其它寄生虫感染有明显差别。试验者认为其特异性和灵敏性不低于ELISA。张玉光等用人工感染3个月以上大鼠的膈肌及腿内侧肌制成冰冻切片作为抗原,用IEST和皮内试验对比检测1412名中学生,IEST阳性率为11.4%,皮试阳性率为16.93%。
酶联免疫吸附试验(ELISA)是目前公认的检测旋毛虫特异抗体的较好的方法,有极高的敏感性和特异性。国外已将检查旋毛虫的ELISA方法作为猪只屠宰前的常规检查。我国经过长期实践,实验技术也得到了不断地改进,已从常规的ELISA发展为SPA-ELISA、DOT-ELISA等,旋毛虫ELISA诊断试剂盒也研究成功并推广试用。现今ELISA已广泛应用于旋毛虫病的流行病学调查和临床诊断。但是ELISA也有缺陷:其操作相对较繁琐且要求的实验条件也较高,基层应用尚有一定困难。
猪旋毛虫病的临床症状如何,如何进行初步诊断?
有时病猪还表现出眼睑和四肢水肿。根据临床症状只能怀疑,猪屠宰后,切下膈肌角,撕去表面肌膜和脂肪后,两手将肌肉拉紧在光线好的地方观察,肉眼可见菜籽粒大小呈乳白色的旋毛虫包囊,即可确诊。
猫旋毛虫病的诊断方法
皮内反应试验、沉淀反应试验等。1、皮内试验皮内试验是用来进行特异性过敏原检查的,也可以诊断出猫是否患有旋毛虫病。2、沉淀实验主要包括絮状沉淀试验,环状沉淀试验和凝胶内的沉淀试验,可以测试出猫体内是否患旋毛虫。
如何防治猪旋毛虫病?
检验时常用的压片方法是:取横膈膜肌角,先用肉眼观察肌纤维内是否有小白点样病灶,剪下24个似麦粒大小的肉块,并列夹在两个小玻璃片中,将小肉块压薄后,用低倍镜检查,观察肌纤维间有无旋毛虫幼虫的包囊。按规定,若24个小肉块中发现不超过5个包囊钙化了的幼虫时,可将病猪肌肉和心脏切成小片煮熟...
猪旋毛虫病鉴别诊断
除了直接肉眼观察,血清学检查也是诊断的重要环节。常用的血清学检测方法包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接血凝抑制试验、皮内实验和沉淀实验。这些实验旨在检测血液中是否存在旋毛虫的特异性抗体,如果抗体水平增加,那么就可以确立猪旋毛虫病的诊断。
旋毛虫诊断
如果患者有生食或食用未熟肉类的经历,并表现出典型的临床症状,比如嗜酸粒细胞计数增多,这可能会引发对旋毛虫感染的怀疑。确诊旋毛虫病通常依赖于实证检查,例如从患者食用过的剩余肉品或活体肌肉组织样本中发现幼虫或囊包。这些是直接的病理证据,能够确证诊断。免疫学检测如皮内试验、沉淀试验、荧光抗体试验...
猪旋毛虫病的鉴定与处理
方法是从肉样上剪下麦粒大的肉片24块,摊平在载玻片上,排成两行,用另一载玻片压上,两端用橡皮筋缚紧,置低倍镜下检查,观察肌纤维间有无旋毛虫幼虫的包囊。 消化法:取肉样,用搅肉机搅碎,加人工胃液消化,使幼虫从肌纤维间分离出来,然后镜检。此法可用于轻度感染的病例,操作较复杂,但检出...
旋毛形线虫实验诊断
酶联免疫吸附试验尤其适用于急性期病人,且在国外被列为猪宰杀前常规检测手段之一。其他如间接血凝试验、对流免疫电泳和间接免疫过氧化物酶染色法也可用于诊断和流行病学研究。为了提高诊断的可靠性,建议结合使用2-3种方法。综上,旋毛虫病的诊断需要结合临床症状、病史和多种实验室检查手段,以确保准确性...
脑旋毛虫病诊断方法
在体检时,医生会发现患者肌肉内存在可触诊的旋毛虫结节。实验室检查方面,大便样本中通常可以检测到成虫的存在,而在脑脊液中,有时可以发现幼虫,且通常会伴随嗜酸性粒细胞计数的增加。此外,血清和脑脊液的免疫反应测试结果也常常为阳性,这进一步支持了诊断。
旋毛形线虫的实验诊断
旋毛虫病的临床表现比较复杂,由于病程的发育可有不同的表现,故单从临床症状及时作出准确的诊断较为困难。应结合询问病人有无食入过生肉或未熟肉的病史,以及有群体发病的特点,并能从患者肌肉内活检出幼虫囊包为确诊依据。血清学方法可协助诊断。 旋毛虫具有较强的免疫原性,因此免疫诊断有较大意义。目前...
简述旋毛虫幼虫的病原学检查方法。
用外科手术方法从患者疼痛的横纹肌(多为腓肠肌或肱二头肌)取米粒大小肌肉,置载玻片上,加50%甘油1滴,盖上另一张玻片,压紧后固定玻片两端,置低倍镜下观察。或用人工消化沉淀法:将肌肉组织剪碎,加5倍量人工消化液(胃蛋白酶0.6g,盐酸1ml,蒸馏水99m1)浸泡,置37%温箱中过夜,次晨加水自然...