如何确定参与参与蛋白质相互作用的氨基酸序列
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发布时间：2022-04-24 17:24
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时间：2023-10-25 23:37
方法比较多。为了简单起见，我把问题假设成已知蛋白A与B在物理层面上互作，寻找蛋白B中参与互作的氨基酸序列。（假设互作的确实是一段氨基酸序列而并非某个结构）
截短。如果B蛋白存在多个domain，那么互作的位点有可能位于其中一个或者几个domain中（因为domain的折叠相对独立，所以截短domain对肽链结构的影响比较小）。利用分子生物学的方法，构建不同长度不同domain的蛋白B的截短突变体，然后分别常识和蛋白A互作（比如pull-down）。由此可以确定互作的序列存在于哪个domain，而哪个domain并不参与互作。
消化。截短的方法已经可以帮我们很大程度上缩小目标范围了。然后我们可以尝试一下把这个domain用蛋白酶消化，我们可以随机消化或者定向消化成一定大小的肽段。利用亲和层析的方法，可以帮助我们从中找出与蛋白A互作的肽段。
比如我们先用化学偶联的方法，把蛋白A 挂到柱子上，然后让蛋白B的domain消化后的肽段混合物通过柱子（在低盐环境下），这样与蛋白A互作的肽段会遗留在柱子上。然后利用高盐环境洗脱这些肽段（高盐环境一般会破坏蛋白间的互作），那么洗下来的就应该是互作的肽段。质谱测序和N端测序的方法可以有效帮助我们辨识这些肽段。
合成小肽。如果我们能够确定出几个candidates（候选），那么这几个肽段就有进一步实验下去的价值了。人工合成这几个小肽，然后让他们去和蛋白A互作。ELISA之类的方法可以有效的帮助我们监控这个过程。借此，我们从中找出互作最强的那个小肽（或者说你也可以认为有好几个肽段都在与蛋白A互作，这就基于自己的判断了）。因为这个时候我们已经很明确的了解这段序列了，我们也可以不停的增加删减氨基酸来寻找最合适的一段长度。
确定互作的强度。为了进一步明确这个互作的机理，我们可能会需要一些其他的参数等等，比如解离常数K、EC50。那么这个时候，ITC（量热示查）、BLI等等的一些技术可以帮助我们进一步了解机理。
验证。以上这些方法，都有一定的假阳性的可能，所以需要验证。我提供一个方法，利用突变的方法。在获得氨基酸序列和一些参数之后，我们可以分析一下互作的机理，然后判断出哪些氨基酸怎样的特性是关键。然后我们对蛋白B上面对应的氨基酸利用PCR进行特定的单点突变和多点突变。重新验证这些蛋白B突变体和蛋白A的互作能力。
借此，我们就可以判断出参与互作的氨基酸序列。
还有另外一条道路可以实现目标。这个方法，以上这些12345全都可以不做。
这个方法就是——解结构。
两个蛋白，如果互作很强，那么就会形成一个比较稳定的蛋白复合体。我们可以针对这个蛋白复合体进行结构生物学的研究。直接解出这个蛋白符合体的结构，那么他们互作的位点，相互的空间关系等等，一目了然。
结构的方法有两种。
1，结晶。结晶进行X-ray衍射。分辨率很高，方法也很经典。不过必须要先能够成功结晶。注意，蛋白复合体的结晶，绝对比单个蛋白要难上很多，很难拿到晶体。你可能好几年拿不到晶体（那时候12345早做完了）。
2，电镜。电镜接结构是近年来流行的方法。优点是很简单，不结晶，直接冷冻，快、简单、傻瓜式操作。缺点是要求蛋白分子量比较大。100kD以上才能看见，200kD才比较容易。而且电镜中，需要用肉眼判断复合体（真的是肉眼，几十万个particle都是人眼挑的）。也就是说，需要用肉眼在电镜下就能分辨出哪个是蛋白A哪个是蛋白B哪个是复合体。所以要求蛋白A和蛋白B的分子量都要比较大才好。
以上两条路子。前一条是经典的生化的法子，缺点是不直接、而且假阳性比较大，优点是方法经典、成功率比较高。并且生化的路子还可以提供一些相关的参数。后一条是结构的路子，优点是直接、清晰，缺点是成功率没有保证，而且对于蛋白本身性质的要求颇多。
