流行性感冒诊断标准及处理原则的诊断标准
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发布时间：2022-04-25 05:24
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时间：2023-10-29 21:52
流行病学史
在流行季节一个单位或地区同时出现大量上呼吸道感染病人；或近期内该地区或邻近地区上呼吸道感染病人明显增多；或医院门诊上呼吸道感染病人明显增多。
病原学诊断方法
A1 病毒分离
从疑似流感病人呼吸道采集标本分离病原体。
A2 标本的收集和处理
A2.1 标本收集时间应于发病早期（1～3d内）越早越好。
A2.2 标本收集方法常用棉拭子擦抹法或咽喉漱洗法。棉拭子擦抹法用于采集儿童标本，采集时将灭菌棉拭子稍沾标本收集液（pH7.2～7.6含20%～40%灭菌肉汤的生理盐水或Hanks液或生理盐水），反复擦拭患者咽部数次，然后将此棉拭子放进装有上述收集液的试管中塞上棉塞。咽喉洗漱法用于采集*标本，采集时先让患者咳嗽，然后用10mL左右的收集液反复洗漱咽喉部约1min，吐入管内。如有条件，儿童标本用负压抽吸法抽取鼻咽分泌物，*标本用鼻咽洗液，可提高分离的阳性率。标本采集后置冰壶（4℃）中尽快送实验室。
A2.3 标本的处理：用毛细吸管反复吹打标本液（如为咽拭子标本，先反复挤压咽拭子后弃之），将粘液打散，于4℃静置5～10min，待自然沉淀后取3mL上清，按每毫升加青霉素1000单位和链霉素1000μg，混匀置4℃处理2～4h即可接种。如标本污染较重，可置4℃过夜处理。如预计标本在48h内不能完成接种时，应将标本置低温（最好-70℃）保存。
A3 接种及培养法
最常用鸡胚培养法和组织培养法，有条件的亦可同时用两种方法进行病毒分离。
A3.1 鸡胚培养法：取9～11日龄鸡胚，将处理过的标本液经羊膜腔和尿囊腔各接种0.2mL，每份标本接种3～4只胚，置33～35℃温箱培养3d，然后将鸡胚放置4℃冰箱过夜（或置—20℃冰箱1h再置4℃数小时）可分别收获尿液和羊水，并作初步血凝（其方法是用毛细吸管取1～2滴尿液或羊水，置大孔塑料板内，再加入1～2滴1%鸡红细胞，摇匀后置室温或4℃30～45min观察结果，根据血球凝集程度的不同可分为++++、+++、++、+、±、－），如血凝为+++～++++时，再按系列倍比稀释测定其血凝滴度，如具有一定血凝滴度即可鉴定。如血凝阴性，可盲传2代，如仍为阴性则弃之。
A3.2 组织培养法：用0.2mL处理过的标本液接种于长成单层的原代人胚肾（或猴肾或地鼠肾），或狗肾传代细胞（Madin Darby Canine Kidney，MDCK），每份标本接种4管，置37℃吸附1～2h后弃标本液，再加入每毫升含2μg胰酶的199维持液1mL，于33℃培养7～10d，并逐日观察病变。从第三天开始每隔一天用0.4%鸡或豚鼠红细胞对培养管做红细胞吸附试验（试验前无菌法收获细胞培养上清液），如阴性则用已收获的上清液盲目传代，如阳性则测定上清液的血凝滴度。如标本第1代红细胞吸附试验阴性，可用收获的全部上清液混合进行盲传2代，仍为阴性则弃之。
A4 新分离株的鉴定
新分离流感病毒可用血凝抑制、补体结合、中和以及血细胞吸附抑制等试验方法进行鉴定。最常用和最简单的方法是血凝抑制试验，必要时采用补体结合试验。
A4.1 血凝抑制试验：用当前流行的甲3、甲1及乙型流感病毒代表株的免疫血清与新分离流感病毒做血凝抑制试验，观察新分离株能否被免疫血清所抑制。血凝抑制试验方法见附录B。
A4.2 红细胞吸附抑制试验：取红细胞吸附试验阳性的组织培养管和正常细胞对照管，用Hanks液洗细胞2次，加入经霍乱滤液（RDE）处理（1∶10）的免疫血清0.2mL，再加入Hanks0.6mL，室温作用30min后，再加入0.4%鸡（或豚鼠）红细胞0.2mL，置室温30min后于普通光学显微镜下观察有无血球吸附。如果血细胞吸附被所用免疫血清所抑制，表明所分离的病毒与所用免疫血清型别相一致或接近。
A4.3 补体结合试验：如果用已知的甲型（甲3、甲1）或乙型或丙型流感病毒免疫血清对新分离病毒的血凝均不能抑制，则应考虑可能为甲型流感病毒的新亚型，可用针对甲型、乙型流感病毒核蛋白的免疫血清作补体结合试验定型。
血清学诊断方法
B1 血凝抑制试验方法
B1.1 原理
一些动物红细胞（如鸡、豚鼠等）以及人“O”型血红细胞上有流感病毒受体，遇流感病毒可产生红细胞凝集现象，简称血凝。若将特异性抗体与流感病毒（血凝素）预先作用后再加入红细胞则不产生凝集，称为血凝抑制现象。用定量血凝素与不同稀释度血清抗体作用后，能完全抑制血凝的最高稀释度，即为血凝抑制抗体效价。
B1.2 主要材料
大孔塑料板，1mL吸管或1mL移液器。
B1.3 双份血清收集及处理
急性期血清于发病3d内采取，恢复期血清于发病后2～4周采取。取0.1mL已分离的血清加入0.9（或0.4）mL霍乱滤液（RDE）（即1∶10或1∶5稀释）摇匀，于37℃水浴中过夜，以去除血清中的非特异性抑制素，次日置56℃水浴50min以灭活多余的RDE。
B1.4 流感病毒血凝素制备
流感病毒接种鸡胚后48h收获的尿囊液，加入1/10000硫柳汞防腐。为了延迟尿盐沉淀可先用无菌生理盐水做等量稀释，置4℃备用。
B1.5 鸡红细胞悬液的制备
从静脉或心脏抽取正常健康鸡血，保存于阿氏（Alsevr's）液中，置4℃保存。用前以生理盐水洗3次，末次经2000r/min离心10min，将红细胞用生理盐水配成1%浓度。
B1.6 血凝素滴定
将流感病毒血凝素在大孔塑料板内用生理盐水从1∶5开始做系列倍比稀释，每孔0.25mL再加入等量1%鸡红细胞，摇匀，置室温或4℃30～45min后观察结果，以出现十十血凝的血凝素最高稀释度为其血凝效价，即为1个血凝单位，实验时采用4个血凝素单位，例如血凝素效价为1∶320，为1个单位，4个单位即为1∶80稀释。正式实验前经校对取4个血凝单位用于实验。
B1.7 血凝抑制试验步骤
B1.7.1 将上述已处理的待检血清（1∶10或1∶5）再用生理盐水做系列倍比稀释，每孔加0.25mL。
B1.7.2 加入等量已配好的4个单位血凝素。
B1.7.3 每孔加入0.25mL 1%鸡红细胞，摇匀置室温或4℃30～45min。
B1.8 结果观察
观察结果时将血凝板倾斜数十秒钟，待阴性孔内红细胞自由下滑呈泪滴状时读结果。以出现完全抑制的血清最高稀释度的倒数为抗体的效价。在检测患者双份血清时需在同一次试验中进行，并以恢复期血清抗体效价较急性期抗体效价升高4倍或4倍以上为阳性。
B2 型特异性补体结合试验
B2.1 原理
甲、乙、丙三个型流感病毒各具有特异的可溶性抗原（核蛋白抗原），甲型流感病毒各亚型均具有相同的可溶性抗原，与乙型或丙型的可溶性抗原完全不同，因此可利用补体结合试验来区别它们。当流感病毒出现很大的变异或出现新亚型而引起大流行时，由于来不及充分掌握新分离毒株的性状，常需同时采用补体结合试验和血凝抑制试验对新毒株进行血清学诊断。
B2.2 型特异免疫血清制备
B2.2.1 免疫用抗原
甲型为PR8株和乙型为Lee株均为小鼠适应株。于乙醚麻醉下鼻腔感染12～16g小鼠，每鼠0.05mL，待感染后3～5d大部分小鼠发病、部分死亡时，解剖小鼠。取肺研磨并用生理盐水制成10%的悬液，低速离心去除粗块，取上清鼠肺悬液即为免疫用抗原。
B2.2.2 免疫血清制备
选体重300～500g的健康豚鼠，免前采血3～5mL，分离血清分装冻存留作对照。豚鼠用乙醚轻度麻醉，鼻腔滴入上述鼠肺悬液抗原0.5mL，共免疫3～4次，每次间隔一周，在末次免疫的同时，由腹腔注射鼠肺悬液2mL，一周后试血，如果对同型尿膜抗原的血清效价超过1∶80，而与异型抗原无交叉反应，立即采血分离血清分装冻存于低温（-20℃以下）。试验前血清于56℃水浴灭活30min。
B2.3 可溶性抗原的制备
用甲、乙型流感病毒或新分离病毒按常规接种和收获尿囊液，如尿液血凝在1∶40以上时，收获其尿囊膜，将尿囊膜用盐水洗一次，用无菌剪刀将膜剪成数小块放入试管中，每个鸡胚的尿囊膜加1mL无菌生理盐水，冻化三次，末次化后以3000r/min离心15min，吸出上清即为可溶性抗原，加入1∶10000的硫柳汞防腐，置4℃冰箱至少可用一个月。
B2.4 双份血清采集
收集病人急性期（发病3d内）和恢复期（发病10～30d后）的血清。血清于试验前56℃30min灭活。
B2.5 1%绵羊红细胞悬液制备、溶血素、补体的制备和滴定按常规方法。
B2.6 补体结合试验步骤
按常规进行。
B2.7 结果判定
B2.7.1 被检病毒尿膜抗原与甲型（或乙型）流感病毒免疫血清呈阳性反应则可诊断为甲型（或乙型）流感病毒，如甲、乙均为阴性时，应考虑丙型流感病毒或其他病毒。
B2.7.2 双份血清对甲型（或乙型）抗原有4倍或4倍以上升高，即可诊断为甲型（或乙型）流感病毒感染。
B2.7.3 正常人群补体结合抗体滴度一般在1∶16以下，如单份恢复期血清抗体在1∶32以上时，结合临床症状可作诊断的参考。
B2.7.4 人群血清抗体水平调查中，补体结合抗体在1∶32以上者可作为新近感染流感的证据。
B3 神经氨酸酶抑制试验
B3.1 原理
胎球蛋白（Fetuin）底物经流感病毒的神经氨酸酶作用后，使N乙酰神经氨酸游离出来，经过碘酸盐的氧化作用将N乙酰神经氨酸转化为β－甲醛内酮酸，后者经硫代巴比妥酸作用形成生色团，用有机溶剂提取生色团，并在分光光度计上比色。利用上述反应可测知流感病毒的神经氨酸酶活性，反应的颜色越深酶活性越强。并可选择用于神经氨酸酶抑制试验的标准剂量。神经氨酸酶抑制试验是将标化好剂量的神经氨酸酶(即一定稀释度的流感病毒尿囊液）和系列稀释的被检血清和正常血清起孵育，测知血清作用于神经氨酸酶活性的抑制效价，并计算出血清的神经氨酸酶抑制滴度。
B3.2 器材及试剂
B3.2.1 小试管、10mL吸管及分光光度计等。
B3.2.2 磷酸缓冲液（PBS pH5.9）及生理盐水。
B3.2.3 胎球蛋白底物液：450～500mg冰冻干燥的胎球蛋白加蒸馏水10mL，溶解后置4℃保存，每周新配。
B3.2.4 过碘酸钠溶液：称4.8g过碘酸钠（NaIO（下标始）4（下标终)）溶于38mL蒸馏水中，加62mL正磷酸（浓），充分混合，置于棕色磨口瓶中，室温保存。
B3.2.5 砷试剂：称10g砷酸钠（NaAsO（下标始）2（下标终））和7.1g无水硫酸钠溶于100mL蒸馏水中，加0.3mL浓硫酸，置于带玻璃塞的瓶中，置4℃保存。
B3.2.6 硫代巴比妥酸试剂：称1.2g硫代巴比妥酸和14.2g无水硫酸钠加入200mL蒸馏水中，在煮沸的水浴中加热溶解，每周新配。
B3.2.7 酸化丁醇试剂：于100mL正丁醇中加入5mL浓盐酸，置棕色带玻璃塞的瓶中，室温保存。
B3.3 神经氨酸酶活性测定
B3.3.1 病毒用生理盐水做系列倍比稀释（1∶2～1∶32）分装小试管，每管0.1mL。标准病毒和未知病毒的神经氨酸酶应在同一试验中测定。
B3.3.2 每管补充加入0.1mL生理盐水，再加入0.1mL用pH5.9 PBS配制的胎球蛋白底物，对照管用盐水代替病毒，充分混合后置37℃水浴作用18h。
B3.3.3 从水浴中取出试管在室温冷却，每管加入0.1mL的过碘酸盐试剂，充分混合，室温静置20min（时间要准）。
B3.3.4 每管加入1mL砷试剂，由于碘的释放出现棕色，摇动试管待棕色消失。
B3.3.5 每管加入2.5mL硫代巴比妥试剂，并充分混合（该试剂需在煮沸溶解后加入），用棉塞将管口堵紧。
B3.3.6 立刻将试管置于煮沸的水浴中，煮沸10min，可见红色出现，即为神经氨酸酶活性的表现，颜色越深酶活性越高。
B3.3.7 将试管置冰水中冷却后去掉棉塞，加入4mL丁醇试剂，换上干净橡皮塞，用手剧烈摇动试管，提取颜色使其转到有机物（丁醇）相。
B3.3.8 以1500r/min离心5～10min使丁醇层清亮透明，小心地吸出上层的丁醇，放入干净的试管中待检。
B3.3.9 将上述受检样品由高稀释度到低稀释度依次倾入透光池中，其中第一个透光池加入无病毒的对照管液，将分光光度计波长调至549nm，将对照管调至零，然后依次读取每个稀释度样品的光密度。
B3.3.10 酶单位的计算：酶活性测定时光密度为0.45～0.85的病毒稀释度作为一个酶单位。
B3.4 神经氨酸酶抑制试验
B3.4.1 按上述方法测定酶活性，选用1个酶单位的病毒稀释度（即酶活性测定时光密度为0.45～0.85的病毒稀释度），每管加入0.1mL。
B3.4.2 受检血清做系列倍比稀释，每管病毒加入不同稀释度血清0.1mL，血清对照管是以最低稀释度血清加生理盐水代替病毒，37℃水浴作用1h。以同法做正常血清对照组。
B3.4.3 每管加入pH5.9 PBS配制的胎球蛋白0.1mL，充分摇匀，置37℃水浴中孵育18h。
B3.4.4 自水浴中取出试管，按B3.3.3.～B3.3.7逐步加入前述各种试剂。
B3.4.5 测定光密度时应从低稀释度血清管至高稀释度血清管，检测方法同B3.3.9。
B3.5 神经氨酸酶抑制抗体滴度的计算法
B3.5.1 根据抗血清和正常血清两组试验的实验结果，求得每组血清同一稀释度的光密度之商数，即为经血清作用后所余之酶活性的百分数。血清稀释度越高，残留的酶活性也越高，找出50%酶活性前后两个血清稀释度及其相应的酶活性百分数，按公式计算出血清神经氨酸酶抑制抗体滴度。
B3.5.2 计算公式
式中：A——血清神经氨酸酶抑制抗体效价倒数；
B（下标始）1（下标终）——酶活性高于50%的血清稀释度倒数；
B（下标始）2（下标终）——酶活性低于50%的血清稀释度倒数；
C（下标始）1（下标终）——高于50%的酶活性的百分数；
C（下标始）2（下标终）——低于50%的酶活性的百分数；
50——常数。
B3.5.3 计算举例
先计算血清作用后的酶活性：
然后将对数稀释度换算为几何稀释度：例如10（上标始）－3（上标终）换算为1/1000，10（上标始）－3.5（上标终）换算为1/3200。最后代入公式：
此抗血清的神经氨酸酶抑制效价为1∶1440。
流感快速诊断方法
C1 直接检查呼吸道脱落上皮细胞内抗原
C1.1 原理
由于流感病毒的主要感染部位是在呼吸道上皮细胞，因此在病人呼吸道标本的脱落细胞中含有流感病毒抗原，通过直接检查脱落上皮细胞内抗原即可诊断。检查方法可采用免疫荧光法，一般于3～4h内即可完成，而且可以直接定型。
C1.2 标本的收集和制片
儿童标本最好采用负压抽吸法收集呼吸道分泌物，*标本最好采用鼻咽洗液。可将每份标本分为两份，一份低温冻存备作病毒分离，一份用pH7.2磷酸缓冲液（PBS），将粘液吹打散，1500r/min离心15min去除上清，细胞沉淀用PBS洗1～2次，末次离心后弃上清，加入适量pH7.2 PBS使细胞重悬，滴加于带圈的玻璃片上，自然干燥，冷丙酮固定10min。
C1.3 间接免疫荧光法
C1.3.1 用10%新鲜羊或牛血清封闭标本片，置湿盒中于37℃30min。
C1.3.2 分别加入适当稀释度的抗甲型和乙型流感型特异性单克隆抗体，置湿盒中于37℃放置1h。在PBS中洗两次，共10min。
C1.3.3 加适当稀释度的兔抗鼠荧光素结合物置37℃1h。在PBS中洗三次，共10min，末次用蒸馏水过一下。
C1.3.4 于荧光显微镜下观察结果，观察到三个以上胞浆内或胞核内荧光阳性细胞即可判为阳性。
C2 标本经敏感细胞增殖1代后查抗原
C2.1 原理
病人呼吸道标本经接种敏感细胞（狗肾传代细胞MDCK）增殖1～3d后，将细胞消化分散制成抗原片，再用免疫荧光法或免疫酶染法检查细胞内抗原。由于标本中的病毒在敏感细胞增殖后查抗原，能明显提高其诊断的敏感性，可在细胞病变出现以前查到抗原，可以直接定型，而且比常规鸡胚分离病毒法要快得多，一般24～72h即可诊断。检查方法可采用间接免疫酶染法（C2.5）或间接免疫荧光法（C2.4）
C2.2 标本的收集及处理
儿童标本可采用咽拭子，最好采用负压抽吸法；*标本可采用咽漱液，最好采用鼻咽洗液。标本按附录A（标准的附录）中A2.3方法处理。
C2.3 标本的接种培养及制片
取处理过的标本液0.2mL接种于长成单层的MDCK细胞，每份标本接种3管，置37℃吸附1～2h后弃去标本液，加入每毫升含2μg胰酶的199维持液至1mL，于35℃培养24、48和72h分别取出1管，收集上清备用，将细胞用消化液（1份0.25%胰酶+4份Versene）消化下来，用PBS洗一次，然后滴加于带圈的玻璃片上，自然干燥，冷丙酮固定。同法制备未经感染的正常MDCK细胞片即为正常对照细胞。
C2.4 间接免疫荧光法
C2.4.1 加单克隆抗体同C1.3.2。
C2.4.2 加兔抗鼠荧光素结合物同C1.3.3。
C2.4.3 于荧光显微镜下观察结果，观察到胞浆内或胞核内荧光，而正常细胞片未见荧光，即可判定为阳性。
C2.5 间接免疫酶染法
C2.5.1 加单克隆抗体同C1.3.2。
C2.5.2 加适当稀释度的羊抗鼠酶标结合物，湿盒中置37℃1h，用PBS洗两次10min。
C2.5.3 加邻苯二胺底物液，其配制方法为：4mg邻苯二胺+10mLpH5.0磷酸－柠檬酸缓冲液+15μL双氧水。pH5.0磷酸缓冲液的配制方法为：先分别配制0.1mol/L柠檬酸（C（下标始）6(下标终）H（下标始）8（下标终）O（下标始）7（下标终）·H（下标始)2（下标终）O）（21g/1000mL）和0.1mol/L磷酸氢二钠（Na（下标始）2（下标终）HPO（下标始）4（下标终））（28.4g/1000mL），分别按24.3mL和25.7mL混合后，再加入等量（50mL）双蒸水混合即为pH5.0磷酸盐－柠檬酸缓冲液。加入底物液3～5min即可观察结果。
C2.5.4 于倒置显微镜下观察结果（观察结果时，细胞要湿，如果细胞已干，可以加入一滴自来水），观察到棕红色深染细胞，根据观察到的深染细胞多少记录为++++、+++、++、+、±、－。以观察到+以上深染细胞判为阳性；有时可观察到单个深染细胞被无色或淡红色细胞所包围，而正常细胞对照呈无色或淡红色，亦可判为阳性。
