求助,NCBI设计的引物怎么看好不好
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发布时间：2022-04-25 07:49
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时间：2023-11-04 21:38
引物设计参数：
a
引物长度一般在20bp左右，上下游引物碱基长度不要相差超过4个碱基。
b
引物退火温度一般在58度，不同软件TM使用不同的算法，primer3，primer
5，primer
6，primer
express等一般可以设置在55-58度，beacon
design可以设置在65左右。
c
GC含量一般没什么特殊要求，40-60最好，如果不好设计，30-80也是可以的。
d
产物长度在100-150,80-200也可以，不要在50bp左右，那样和引物二聚体不好区分，超过200bp可能会影响PCR扩增。
e
软件给出的引物不能有发卡结构和超过3-4个碱基的匹配，特别是3`端不能有碱基匹配，那样更容易形成二聚体。
f
引物设计好以后，在NCBI上做一个primer-blast，检测一下是否有非特异性扩增。
最好还是通过实验验证，如果是定量PCR引物
a
溶解曲线单峰，窄而尖，否则可能有非特异性扩增；峰的位置横坐标一般在80度以上，这个温度为PCR产物的解链温度，如果在75度附近，可能是引物二聚体，miRNA染料法检测时，溶解曲线的峰的位置可能在75度附件
b
琼脂糖电泳为明亮的一条带，条带一般在100bp以上，如果设计引物时PCR产物在100bp一下，需要仔细辨认是否为引物二聚体；引物二聚体的条带一般在50bp左右，条带弥散，暗。
c
扩增曲线呈“S”形，一般情况下，S形越陡，扩增效率越高，S形越平，扩增效率低。有时会出现扩增曲线只有线性期，没有指数期的情况，这时一般扩增效率较低，建议检测一下扩增效率，用标准曲线法计算相对表达量。染料法的扩增曲线比探针法的扩增曲线要好看。
d
样品Ct值小于30，对于Ct大于30的情况，建议重新设计一对引物，重新调试。如果几对引物的Ct值都较大，可以适当放宽Ct至35。但是Ct值肯定不能大于35。
