IP的免疫沉淀反应
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发布时间：2022-04-26 09:12
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时间：2022-06-26 11:44
IP-Immunoprecipitation-免疫沉淀反应
免疫沉淀是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后，再与蛋白A/G（ProteinA/G）或二抗偶联的agaose或Sepharose珠子孵育，通过离心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗体-目的蛋白复合物，沉淀经过洗涤后，重悬于电泳上样缓冲液，煮沸5-10min，在高温及还原剂的作用下，抗原与抗体解离，离心收集上清，上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。
免疫沉淀反应（Immunoprecipitation）主要用于抗原或者抗体的定性检测。其原理是指可溶性抗原与相应抗体在有电解质存在的情况下，按适当比例所形成的可见沉淀物现象。据此现象设计的沉淀实验主要包括絮状沉淀试验，环状沉淀试验和凝胶内的沉淀试验。凝胶内的沉淀试验依所用的实验方法又可分为免疫扩散实验和免疫电泳技术2类。 1. 蛋白A 或蛋白G
2. 一抗
3. 免疫沉淀缓冲液：20 mM 磷酸钠，pH 7.5,500 mM NaCl,0.1% SDS,1% NP40,0.5% 脱氧胆酸钠 and 0.02% 叠氮化钠. （> NOTE: 50 mM 醋酸钠缓冲液，pH 5.0,. 500 mM NaCl,0.1% SDS,1% NP-40 and 0.02%叠氮化钠也可作为免疫沉淀的缓冲液，能提高蛋白G的结合功效）
4. 洗脱液：0.1 M 甘氨酸-HCl buffer,pH 2.5
5.SDS-PAGE上样缓冲液 (pH 6.8）：2% SDS,62.5 mM Tris 碱，10% 甘油，2-5%2-巯基乙醇 1. 用50 μl免疫沉淀缓冲液溶解抗原，向溶液中加入1倍过量的特异性一抗。加入免疫沉淀缓冲液至样品体积为0.2 ml。一般情况下，在此体积下2-5μg的纯化抗体能够较好地形成抗原抗体复合物。
2. 样品4℃.孵育过夜。
3. 将适量的蛋白A或蛋白G加到抗原抗体复合物中（~ 50 μl of gel per 5 μg of antibody）。
4. 室温下，轻柔混匀样品，孵育2小时。
5. 用0.5ml免疫沉淀缓冲液洗蛋白A或蛋白G连接的抗原抗体复合物，离心2-3分钟，弃上清。重复此步骤至少6次。
6. 用50 μl洗脱液孵育蛋白A或蛋白G连接的抗原抗体复合物5分钟，将抗原抗体复合物从蛋白A或蛋白G上洗脱下来，离心，收集上清。另用50 μl洗脱液孵育胶5分钟，离心，收上清。将两个上清混合。
7. 立即调节蛋白样品的pH至生理值，用一种合适的、多次离心的缓冲液调节，如1.0 M Tris,pH 7.5 (10 μl of this buffer to 100 μl of the supernatant should be sufficient).
8. 将洗脱成分除盐。
9. 准备好样品待定性。 如果用SDS-PAGE定性蛋白质，省去步骤6-9。在完成第5步之前，用0.5ml蒸馏水洗胶。离心蛋白A或蛋白G 2-3分钟，弃上清。用25μl SDS-PAGE上样缓冲液在95°C孵育蛋白A或蛋白G连接的抗原抗体复合物5分钟。样品离心，收集上清。重复一次，汇集上清至总体积50μl。由此样品则准备妥当。
