免疫磁珠和琼脂糖珠进行免疫共沉淀的区别
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发布时间：2022-04-26 09:12
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时间：2022-06-26 11:44
（1）转染后24-48
h
可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min,
细胞裂解液于4°C，
最大转速离心30
min后取上清；
（2）取少量裂解液以备Western
blot分析，剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；
（3）取10μl
protein
A
琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3
次，每次3,000
rpm离心3
min；
（4）将预处理过的10μl
protein
A
琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein
A琼脂糖珠耦联；
（5）免疫沉淀反应后，在4°C
以3,000
rpm
速度离心3
min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS
上样缓冲液，沸水煮5分钟；
（6）SDS-PAGE,
Western
blotting或质谱仪分析。
注意的问题：
（1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton
X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（0.2%SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktailer。
（2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用。
（3）使用对照抗体：
