做WB为什么用牛奶封闭能显出来 用BSA就显不出来了?
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发布时间：2022-04-26 09:52
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热心网友
时间：2022-06-27 01:10
首先，我们需要了解封闭的目的：减少因非特异性结合而产生的背景。其次，我们需要知道 BSA 和牛奶的区别：BSA 仅由一种蛋白组成，即 60 kDa 的牛血清白蛋白；而牛奶则由许多大小不一的蛋白构成。
所以，CST (Cell Signaling Technology) 推荐牛奶封闭最佳，因为牛奶有更大的机会来减少更多的非特异性结合。我们建议您用经 TBST 稀释的 5% 牛奶，在室温下摇晃一小时，来封闭CST所有非偶联一抗，这包括磷酸化特异性和总抗体。
现在，曾有同学问过，“牛奶中的磷酸酶会怎么样？” 或许有一些文章反对使用牛奶来检测磷酸化信号，这一误区的出现可能是由于实验者使用了非实验级奶粉引起的（国内许多奶粉含有磷酸酶等杂质），但在 CST 的所有内部检测中，科学家们进行了多次蛋白印迹实验，从未发现任何这样的问题。CST建议转膜后迅速在TBS中洗涤膜几秒，以便移除残留的转膜缓冲液，随后使用5%脱脂牛奶（请使用实验级的#9999）的TBST室温封闭1h。另外，CST科学家们每天至少要新鲜配制一次牛奶，有时甚至一天配制多次，因为如果牛奶缓冲液放置了一周、两周甚至更长时间不使用，那么磷酸酶影响信号的机率将会增加。
上图是(Phospho-Akt (Thr308) (D25E6) XP® Rabbit mAb) #13038 用来检测经 PDGF 处理的 3T3 细胞裂解物的结果图片。左侧膜是用牛奶封闭，右侧膜用 BSA 封闭。显然，用 BSA 封闭的膜的背景更高。但用牛奶封闭膜时，磷酸化信号仍然很强且清晰。
封闭后，请仔细查看一抗的说明书，根据推荐的一抗缓冲液来稀释一抗，一般推荐牛奶或 BSA，但取决于不同抗体。
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时间：2022-06-27 01:11
