求论文《水稻秸秆纤维素发酵转化燃料乙醇的研究》
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发布时间：2022-04-30 14:05
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时间：2022-06-22 22:40
水稻秸秆纤维素发酵转化燃料乙醇的研究
摘要
我国水稻秸秆资源丰富，年产量达3亿多吨。利用水稻秸秆生产燃料乙醇，对
来我国能源问题、实现节粮代粮和环保有着巨大的潜力和广阔的应用前景。水稻秸
要成分是纤维素，对纤维素的利用最主要的*性因素是将纤维素转化为可发酵还
解决的办法主要有两类途径:(l)提高纤维素酶生产的经济性，主要涉及纤维素酶高
获得及纤维素酶的生产技术，提高其合成效率以降低单位纤维素酶生产成本;(2)提
素酶利用效率，主要涉及纤维素酶解催化过程，以降低单位可发酵还原糖生产成本
本研究从菌种的选育着手，研究了菌株的产酶特性，用响应面策略优化发酵培养基，
了SL发酵罐分批发酵生产高活力纤维素酶技术;分离纯化了纤维素酶;构建了代
二糖的酿酒酵母工程菌;对酿酒酵母工程菌细胞固定化发酵进行了研究，利用二级
生物反应器祸合系统生物协同酶解水稻秸秆发酵生产燃料乙醇等。主要研究结果如
1.筛选到一株纤维素酶高产菌株(PenicilliumYT01)，原生质体紫外诱变后
变株YT02，YT02以水稻秸秆为碳源，豆饼粉和硫酸钱为氮源，在29”c，初始p
酵12Oh，纤维素酶活力达到最高，摇瓶发酵滤纸酶活(FPA)、CMC酶活(CMcas
葡萄糖昔酶活(CB)分别达3.86IU/mL、207.41IU/mL和l.4oIU/mL。
2.用响应面方法(RSM)优化的发酵培养基组成为:水稻秸秆为41.95留L，
为24.83g/L，数皮为22.16叭，困H4)2504、KHZpO4为4g/L，MgSO;为0.sg/L;起始
以优化的培养基发酵120h，滤纸酶活、cMc酶活和p一葡萄糖普酶活分别达到
IU/mL、357.41IU/mLand3.704IU/mL。远高于优化前的纤维素酶活水平。
3.在SL发酵罐中研究了温度、pH值和溶氧对菌体生长和产酶的影响，确定
发酵的工艺条件为:0一32h时发酵温度犯”C，溶氧70%;犯h至1加h发酵结果发
29oc，溶氧50%，发酵液初始pH值6.0，发酵%h滤纸酶活、CMC酶活和p一葡
酶活分别达到11.13IU/mL、465.24IU/mLand4.08IU/mL，均高于摇瓶发酵水平，
酵动力学过程显示，突变菌YT02菌体生长和纤维素酶各组分均为部分祸联。
4.利用DEAEsephadexA一25和sephadexG一75分离纯化了二个内切葡
(CMCase)和一个p一葡萄糖营酶，CMCase纯化倍数为13.48，回收率为10.54%，
糖昔酶纯化倍数为18.62，回收率为8.62%，经SDS一PAGE得到单蛋白分子条带，
I
、沪’_心钳3卜“’门尸，..
量测定分别为73kDa、43kDa和57.8kDa，并对其进行了N端测序和质谱分析。
5.以生产乙醇性能优良的酿酒酵母菌株NAN一27作为工程菌株的受体菌。利用
能良好的多拷贝整合型载体pYMIKP，使纤维二糖代谢基因BGLI整合到酿酒酵母
体上。从而在酿酒酵母工业菌株中建立了稳定的纤维二糖代谢途径，拓展了酒精生
物利用范围，降低了纤维二糖对纤维素酶解的抑制作用。采用海藻酸钙凝胶包埋固
纤维二糖酿酒酵母工程菌，固定化细胞与游离细胞相比，发酵时间缩短，乙醇产率提
以上，并能有效地利用水稻秸秆水解液进行酒精发酵。
6.对水稻秸秆酶解过程中底物性质、酶解温度、酶解pH、底物浓度及纤维素
等关键因子进行了研究。由于YT02纤维素酶系中纤维二搪酶活力较低(CB/F队为
经稀酸稀碱预处理后的水稻秸秆纤维素对乙醇转化率仅为18%。采用代谢纤维二糖
母工程菌游离细胞发酵，可部分去除纤维二糖对酶解的抑制，水稻秸秆纤维素对乙
率可提高至20%。进一步利用采用海藻酸钙凝胶包埋固定代谢纤维二糖酿酒酵母工
酵，水稻秸秆纤维素对乙醇转化率可达26%。这方面的研究结果有助于深入了解纤
的协同降解机制。
7.将纤维原料的酶解、固定化代谢纤维二搪酿酒酵母工程菌的作用有机祸联，
新型的二级串联式生物反应器，在该反应器体系的协同作用下，可有效解除纤维二
萄糖对纤维素酶的反馈抑制作用，促进纤维原料水稻秸秆的酶水解，发酵40h，乙
达25.5留L，纤维素对乙醇的转化率达43.0%(纤维素对乙醇的理论转化率为56.61
是游离细胞同时糖化发酵(SSF)的1.65倍，生产效率达0.64留(Lh)。采用分批添料
酶解发酵工艺，可提高纤维底物的终浓度达250岁L，产物乙醇的终浓度66.51留L，
高了纤维素酶的利用率和乙醇生产效率，降低乙醇的生产成本。该反应器性能稳定
效率高，固定化细胞可以重复使用，便于自动化控制。
关键词:纤维素酶，水稻秸秆，酿酒酵母，燃料乙醇，串联式生物反应器
目录
摘要..............................................................……
ABSTRACT..........................................................……IH
第一章文献综述
l水稻秸秆资源及其降解方式............................................……l
1.1水稻秸秆的组成与结构..…，................................……，.……l
1.2水稻秸秆的预处理..................................................……3
1.2.1物理方法预处理水稻秸秆..........................................……3
1.2.2化学方法预处理水稻秸秆..........................................……3
1.2.3生物方法预处理水稻秸秆..........................................……4
1.3水稻秸秆纤维素的降解方式..........................................……4
1.3.1水稻秸秆的酸水解................................................……5
1.3.2水稻秸秆的酶水解................................................……5
2纤维素酶的性质与用途................................................……6
2.1纤维素酶的多酶体系................................................……6
2.2纤维素酶的分子结构................................................……7
2.3纤维素酶的作用机理................................................……9
2.4纤维素酶的分子量大小.............................................……10
2.5纤维素酶的最适反应条件与稳定性...................................……11
2.6纤维素酶的应用...................................................……H
3纤维素酶的生产.....................................................……12
3.1纤维素酶的生产菌种选育...........................................……12
3.2纤维素酶的生产...................................................……14
4水稻秸秆原料生物转化燃料乙醇.......................................……15
4.1燃料乙醇的优越性和使用现状.......................................……15
4.2水稻秸秆纤维素生物转化燃料乙醇的方法.............................……16
4.2.1分步水解发酵法生产燃料乙醇.....................................……16
4.2.2同步糖化发酵法生产燃料乙醇.....................................……16
i
4.2.3固定化细胞发酵生产燃料乙醇.....................................……17
4.3酉良酒酵母途径工程应用于燃料乙醇的生产.............................……17
5本研究的目的、意义和主要内容.......................................……19
5.1本研究的目的和意义...............................................……19
5.2本研究的思路和技术路线...........................................……20
5.3本研究的主要内容.................................................……21
第二章纤维素酶高产菌株的选育及产酶条件研究.........................……23
1材料与方法..........................................................……23
1.1材料.............................................................……23
1.1.1试剂与溶液配制.................................................……器
1.1.2菌种与菌种分离源...............................................……24
1.1.3培养基.........................................................……24
1.1.4主要仪器与设备.................................................……25
1.2方法.............................................................……25
1.2.1水稻秸秆的预处理...........................……，.，...........……25
1.2.2纤维素酶高产菌的分离与纯化.....................................……25
1.2.3纤维素酶高产菌的初步鉴定.......................................……25
1.2.4纤维素酶高产菌的原生质体紫外诱变...............................……25
1.2.5YTOZ产纤维素酶的液体发酵培养方法...............................……26
1.2.6不同预处理水稻秸秆的酶水解.....................................……27
1.2.7分析方法.......................................................……27
2结果与分析.........................................................……29
2.1不同预处理水稻秸秆的各组分含量...................................……29
2.2纤维素酶高产菌的分离与筛选.......................................……29
2.3纤维素高产菌YT01的菌种鉴定......................................……31
2.4纤维素酶高产菌YT01的原生质体紫外诱变............................……31
2.5液体发酵培养基成分与发酵条件对YT02产纤维素酶的影响..............……32
2.5.1不同碳源对YT02产酶的影响......................................……32
2.5.2不同预处理水稻秸秆对YT02产酶的影响............................……33
2.5.3不同氮源对YT02产纤维素酶的影响................................……34
ii
2.5.4微晶纤维素添加量对YT02产纤维素酶的影响........................……35
2.5.5不同无机盐对YT01产纤维素酶的影响..............................……35
2.5.6起始pH对YT01产纤维素酶的影响.................................……36
2.5.7装液量对YT02产纤维素酶的影响..................................……37
2.5.8转速对YT02产纤维素酶的影响....................................……37
2.5.9培养温度对YT02产纤维素酶的影响................................……38
2.5.10接种量对YT02产纤维素酶的影响.................................……39
2.5.n培养时间对YT02产酶的影响.....................................……40
2.6纤维素酶的酶学性质研究...........................................……41
2.6.1温度对纤维素酶各组分酶活的影响................................……41
2.6.ZPH对纤维素酶各组分酶活的影响..................................……41
2.7纤维素酶对不同预处理水稻秸秆的酶解试验...........................……42
3结论与讨论...............................................··········……4:l
3.1关于筛选出的纤维素酶高产菌株....................................……4:3
3.2纤维素酶生产菌的改造............................................……招
3.3青霉YT02产酶条件与酶学特性.....................................……44
第三章YT02产纤维素酶发酵培养基的优化研究..........................……45
1材料与方法....................................···.·················……45
1.1材料.............................................................……45
1.1.1试剂................................................·.·.·······……45
1.1.2供试菌种.......................................················……45
1.1.3培养基................................................·········……45
1.1.4主要仪器与设备.................................................……46
1.2方法.............................................................……4尽
1.2.1实验设计.............................................··········……46
1.2.2培养方法.............................................··········……46
1.2.3分析方法.......................................................……46
2结果与分析..............................................···········……47
2.1部分因子实验筛选发酵培养基的主要影响因子.........................……47
2.2最陡爬坡实验*近发酵培养基最优点.................................……50
111
2.3中心组合设计优化YT02发酵培养基组成..............................……51
2.4发酵过程中PH、残余还原糖与纤维素酶变化的测定结果.................……59
3结论与讨论...................................……，...............……61
第四章YT02分批发酵产纤维素酶的研究................................……63
材料与方法.........................................................……63
.1材料.............................................................……63
.1.1试剂...........................................................……63
.1.2菌株...........................................................……63
.1.3培养基.........................................................……娜
.1.4主要仪器.......................................................……64
方法.....................·······……
.1用于分批发酵的种子培养.........……
.…64
.…64
1.2.2恒温分批发酵对YT02产纤维素酶的影响.............................……64
1.2.3变温分批发酵对YT02产纤维素酶的影响.............................……64
1.2.4溶氧量对YT02分批发酵产纤维素酶的影响...........................……64
1.2.5分段溶氧对YT02分批发酵产纤维素酶的影响.........................……65
1.2.6分析方法.......................................................……65
2结果与分析.........................................................……65
2.1发酵温度对YT02产纤维素酶的影响结果..............................……65
2.2变温发酵对YT02产纤维素酶的影响结果..............................……68
2.3溶氧对YT02产纤维素酶的影响结果..................................……69
2.4分段溶氧分批发酵对YT02产纤维素酶的影响结果......................……72
3结论与讨论.........................................................……73
第五章YT02产纤维素酶的分离纯化及酶学性质研究...........……
以U（b叮‘叮‘
（bt了叮‘叮‘
材料与方法…
.1材料.……
.1.1试验材料.
.1.2主要试剂.
....……76
.....……76
.3常用储备液及缓冲液....................................……
1.1.4主要仪器........................................................……78
1.2方法..............................................................……78
1.2.1蛋白质浓度的测定方法...........................................……78
1.2.2纤维素酶的分离纯化.............................................……79
1.2.3纤维素酶SDS一PAGE凝胶电泳纯化及酶相对分子量的测定..............……83
1.2.4酶蛋白的N端测序...............................................……85
1.2.5酶蛋白的质谱分析...............................................……86
2结果与分析.........................................................……87
2.1DEAE一SephadexA一25阴离子交换层析结果.............................……87
2.1.1层析收集管酶蛋白同洗脱缓冲液NaCI浓度的关系.....................……87
2.1.2层析收集管酶蛋白活性检测.......................................……88
2.25即hadexG一75分子筛凝胶过滤层析结果..............................……88
2.2.1SephadexG一75分子筛凝胶过滤层析分离酶蛋白......................……88
2.2.2分子筛凝胶过滤层析纤维素酶活测定结果...........................……88
2.3纤维素酶各纯化步骤纯化情况.......................................……89
2.4SDS一PAGE聚丙烯酸胺凝胶电泳.......................................……90
2.4.1SDS一PAGE聚丙烯酸胺凝胶电泳银染结果.............................……90
2.4.2纤维素酶分子量SDS一PAGE凝胶电泳测定结果........................……91
2.5酶蛋白的N端测序结果.............................................……91
2.6酶蛋白的质谱分析结果.............................................……93
3结论与讨论.........................................................……94
第六章酿酒酵母纤维二糖代谢途径的构建及其细胞固定化研究.............……96
材料和方法................................................·········……%
1材料.............................................................……96
1.1菌株和质粒.....................................................……96
1.2分子克隆用酶和试剂.............................................……96
1.3水稻秸秆水解液的制备...........................................……97
2方法.............................................................……98
2.1含纤维二糖酶基因(及咒1)的重组质粒pYMIKP一那艺了的构建方法.......……98
2.2酿酒酵母纤维二糖代谢途径的搭建方法.............................……99
1.2.3酿酒酵母工程菌细胞的固定化方法................................……101
1.2.4固定化酵母细胞发酵方法........................................……102
1.2.5分析方法......................................................……102
2结果与分析........................................................……103
2.1表达及范了基因的重组菌株的构建结果...............................……103
2.1.1目的基因及法了的获得...........................................……103
2.1.2含目的基因那Z了重组质粒的构建.................................……103
2.1.3酿酒酵母工业菌株NAN一27转化子的获得二，........................……104
2.1.4转化子NAN一28细胞纤维二糖酶活性测定结果.......................……1()4
2.2不同固定化条件对NAN一28细胞固定化的影响结果.....................……105
2.2.1不同溶剂对固定化细胞转化纤维二搪的测定结果......……，.......……105
2.2.2不同海藻酸钠浓度对固定化细胞凝胶特性的影响....................……l()5
2.2.3酵母包埋量对固定化细胞转化纤维二糖的影响结果..................……!06
2.3固定化细胞与游离细胞分批发酵实验结果............................……l()6
2.4固定化细胞重复分批发酵试验结果..................................……107
3结论与讨论........................................................……108
3.1酉良酒酵母纤维二糖代谢途径的构建.................................……108
3.2酿酒酵母工程菌细胞固定化.......................................……110
第七章串联式生物反应器转化水稻秸秆生产燃料乙醇的研究..............……112
材料与方法........................................................……112
l材料......................................……，..............……112
1.1试剂.........................................................……112
1.2菌种.........................................................……112
1.3主要仪器与设备...............................................……112
2方法...........................................................……112
2.1稻草粉的预处理................................................……112
2.2纤维素酶的制备................................................……113
2.3稻草粉的酶解糖化..............................................……113
2.4水稻秸秆生物转化燃料乙醇......................................……114
2.5测定方法......................................................……115
vi
2结果与分析........................................................……116
2.1不同预处理方法对水稻秸秆糖化效果的影响结果......................……116
2.2不同温度对水稻秸秆糖化效果的影响结果............................……116
2.3不同pH对稻草粉糖化效果的影响结果...............................……117
2.4不同加酶量对稻草粉糖化效果的影响结果............................……118
2.5不同底物浓度对稻草粉糖化效果的影响结果..........................……118
2.6水稻秸秆同步糖化发酵(SSF)结果.................................……119
2.7串联式反应器转化水稻秸秆生产乙醇................................……120
2.7.1固定化NAN一28细胞发酵生产燃料乙醇结果.........................……120
2.7.2串联式生物反应器的稳定性结果..................................……121
2.7.3分批添料式协同酶解发酵生产燃料乙醇结果........................……122
3结论与讨论......................................................··……122
3.1二级串联式生物反应器生产乙醇....................................……122
3.2分批添料式协同酶解发酵工艺......................................……123
3.3水稻秸秆资源的全利用............................................……123
第八章结论.....................................................……124
主要参考文献......................................................……126
英文缩写与主要符号表...............................................……146
本研究的特色与创新.................................................……147
发表与待发表的学术论文及成果.......................................……148
致谢............................................................……149
作者简介..........................................................……150
你要看哪部分？
