怎样提取粪便DNA
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发布时间：2022-04-30 14:54
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时间：2022-06-25 18:24
提取粪便DNA可以直接用粪便DNA提取试剂盒，使用步骤：
使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶体上的标签。所有离心步骤均为使用台式离心机
在室温下离心。
1、称取粪便样本 0.1-0.5g，在液氮中充分研磨成细粉末，加入 450ul 溶液 A 震荡混匀。
* 也可直接称取样本 0.1-0.5g 于离心管(建议使用 2ml 圆底管)，加入 450ul 溶液 A 剧烈震荡混匀
1-2min 至没有固体块。 使用液氮研磨效果最佳。
2、加入 50ul 溶液 B 充分颠倒混匀( 不要剧烈震荡)，65℃水浴 6min，每 2min 充分颠倒混匀一次。
3、加入 100ul 溶液 C 充分颠倒混匀( 不要剧烈震荡)，12000 rpm 离心 10min 。
4、将上清转移到新的离心管，12000rpm 离心 2min 。
5、在吸附柱中加入 200ul 溶液 D ，将离心后的上清加入到带有溶液 D 的吸附柱中，用移液器吹吸几次混
匀，12000 rpm 离心 1min。
6、将收集管中的滤出液混匀后重新吸入吸附柱( 必须)，12000 rpm 离心 1min。
7、倒掉收集管中的废液，在吸附柱中加入漂洗液 500ul，12000 rpm 离心 1min。
8、倒掉收集管中的废液，重复步骤 7 两次(共漂洗三次)。
9、倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管，12000 rpm 离心 2min 。
10、拿出吸附柱在室温干燥数分钟( 因季节及气候等因素不等)，或 50℃干燥 1min。
11、将吸附柱放入一个新的离心管中，加入 50-100ul 洗脱液(65 ℃预热)，12000 rpm 离心 1min。
12、将离心管中的液体重新加入到吸附柱中，12000 rpm 离心 1min。离心管中即为粪便微生物 DNA 溶液。
注意事项：
1、新鲜的粪便样本会得到更高的产率，不同样本在采样前应先查阅相应的最佳保存条件。
2、若溶液中出现浑浊可在 37℃水浴中溶解片刻至清澈，不会影响结果。
3、在需要吸取上清液的步骤中应避免吸到沉淀，否则会堵塞吸附柱，并影响产物纯度。
4、洗脱缓冲液的体积最好不少于 50ul ，体积过小会影响回收效率；建议使用试剂盒附带的洗脱缓冲液，
用水洗脱也会损失部分产物；DNA 应保存在-20 ℃避免反复冻融，以防降解。
5、 液体试剂避免接触皮肤，若意外接触应立即使用大量清水冲洗。
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时间：2022-06-25 18:24
1、固态粪便提取：称取0.1 g粪便样本转移至一个干净的离心管，向离心管加入450 μL裂解液，5 μL蛋白酶K，0.1 g氧化锆（可选用，能提高革兰氏阳性菌研磨破壁率），充分混匀30 S-60 S（非常重要），70℃金属浴裂解10 min，中间混匀一次。
液态粪便提取：若为保存液粪便，且保存液较澄清，充分混匀悬浮后，取500 μL悬液，直接12000 rpm离心1 min，取上清200 μL，加入450 μL裂解液，5 μL蛋白酶K，70℃金属浴裂解10 min。
粘稠液态粪便：使用保存液按照900 μL~1200 μL保存液/1g粪便的比例混合重悬，12000 rpm离心1 min，取200 μL上清。加入450 μL裂解液，5 μL蛋白酶K，70℃金属浴裂解10 min。
土壤提取：称取0.25-0.3 g土壤转移至离心管，向离心管加入450 μL裂解液，5 μL蛋白酶K，0.1 g氧化锆，充分混匀30S-60S（非常重要），70℃金属浴裂解10 min，中间混匀一次。
2、（尽量避免取到上层油状物，液态粪便可省去此步操作）裂解结束，12000 rpm离心2min，取400 μL上清液到新的1.5 mL或2.0 mL离心管中。。
3、向离心管加入150 μL除杂剂，充分混匀，4℃冰浴5 min。
4、取400 μL 磁珠至 1.5 mL或2.0 mL离心管中（注意：为了确保磁珠彻底重悬，请充分振荡混匀后立即吸取），置于磁力架上静置 1 min 后将全部上清吸出，磁珠保存待用
5、冰浴结束后，将离心管12000 rpm 离心2 min，取400 μL上层清液，至磁珠保存待用的离心管中。
6、向离心管中加入500 μL结合液，振荡混匀1 min，室温静置10 min，每3 min混匀一次。
7、将离心管置于磁力架上，静置1 min，期间颠倒磁力架5~6次，使管盖上的磁珠被磁力架吸附，用移液器吸去管盖和管中的液体。
8、取下离心管，加入500 μL洗涤液Ⅰ，将离心管充分振荡混匀2 min后，期间颠倒磁力架5~6次，使管盖上的磁珠被磁力架吸附，置于磁力架上，静置30 s，磁珠完全吸附后，吸弃上清。
9、取下离心管，加入600 μL洗涤液II，将离心管充分振荡混匀2 min后，期间颠倒磁力架5~6次，使管盖上的磁珠被磁力架吸附，置于磁力架上，静置30 s，磁珠完全吸附后，吸弃上清。
10、重复步骤9。
11、步骤10吸弃上清后，打开管盖，室温干燥2 min至乙醇充分挥发。
12、取下离心管，加入100 μL洗脱液，振荡混匀使磁珠完全浸没在洗脱液中，再置于65 ℃孵育10 min，期间混匀2次。
13、将离心管短离心，置于磁力架上，静置30 s，待磁珠完全吸附，用移液器将液体转移至一新离心管中（切勿吸到磁珠），所得溶液即为提取的核酸样品。
14、该样品可以直接用于下游实验，若要长时间保存，请置于-20 ℃冰箱。
热心网友
时间：2022-06-25 18:25
