碱裂解法制备质粒dna时,溶液1,2,3中各组分都起什么作用
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发布时间：2022-04-30 15:02
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时间：2022-06-25 21:10
碱裂解法制备质粒DNA时，溶液Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ中各组分的作用：
1、溶液Ⅰ：
葡萄糖是使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，其主要目的是为了螯合二价金属离子从而达到抑制DNase的活性；可添加RNase A消化RNA。
2、溶液Ⅱ
此步为碱处理。其中NaOH主要是为了溶解细胞，释放DNA，因为在强碱性的情况下，细胞膜发生了从双层膜结构向微囊结构的变化。SDS与NaOH联用，其目的是为了增强NaOH的强碱性，同时SDS作为阴离子表面活性剂破坏脂双层膜。这一步要记住两点：
第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DN*断也会慢慢断裂；
第二，必须温柔混合，不然基因组DNA会断裂。
3、溶液Ⅲ
溶液III的作用是沉淀蛋白和中和反应。其中醋酸钾是为了使钾离子置换SDS中的钠离子而形成了PDS。
因为十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾 （potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是不溶水的，同时一个SDS分子平均结合两个氨基酸，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了。
2 M的醋酸是为了中和NaOH。基因组DNA一旦发生断裂，只要是50－100 kb大小的片断，就没有办法再被 PDS共沉淀了，所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。
75%酒精主要是为了清洗盐份和抑制Dnase；同时溶液III的强酸性也是为了使DNA更好地结合在硅酸纤维膜上。
扩展资料
质粒抽提的窍门
（1）加溶液II（裂解液）后，操作一定要温和，剧烈混合会导致基因组DNA污染。
（2）洗脱时60℃温育（Ellution Buffer）洗脱缓冲液或去离子水效果更好。
（3）若质粒提取含量低，可增加菌液样或换用ArtMedia Plasmid Culture，其比LB培养基质粒得量高。
（4）菌体应彻底悬浮 ， 如果没有彻底悬浮菌体，则残留的菌体团块在溶液 II 加入后，变成难以完全裂解的团块。这个团块在溶液 III 加入后，会有一部分蛋白质继续存在于溶液中，成为蛋白质残留的最大根源。
（5）加入溶液 II 后，混匀，体系最好能立即变得清澈。体系如果变得清澈了，马上加入溶液 III 中和。
（6）中和的操作 ，在 1.5ml 离心管中加入溶液 III 后，先颠倒两次，使管底朝上，用指头弹击管底数次，再颠倒混匀。效果非常好。
参考资料来源
百度百科-质粒抽提
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时间：2022-06-25 21:10
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时间：2022-06-25 21:11
1.
溶液Ⅰ: 葡萄糖是使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部;EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂,其主要目的是为了螯合二价金属离子从而达到抑制DNase的活性;可添加RNase A消化RNA。
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溶液Ⅱ 此步为碱处理。其中NaOH主要是为了溶解细胞,释放DNA,因为在强碱性的情况下,细胞膜发生了从双层膜结构向微囊结构的变化...
3.
溶液Ⅲ 溶液III的作用是沉淀蛋白和中和反应。其中醋酸钾是为了使钾离子置换SDS中的钠...
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时间：2022-06-25 21:11
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