cDNA感染性克隆的概念和原理
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发布时间：2022-04-30 03:33
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时间：2023-08-01 00:09
①有些生物，如RNA病毒没有DNA，只能用cDNA克隆；
②cDNA克隆易筛选，因为cDNA库中不包含非结构基因的克隆，而且每一cDNA克隆只含一个mRNA的信息；
③cDNA能在细菌中表达。cDNA仅代表某一发育阶段表达出来的遗传信息，只有基因文库才包含一个生物的完整遗传信息。
1.方法：
(1)DN*段的制备：常用以下方法获得DN*段：①用*性核酸内切酶将高分子量DNA切成一定大小的DN*段；②用物理方法(如超声波)取得DNA随机片段；③在已知蛋白质的氨基酸顺序情况下，用人工方法合成对应的基因片段；④从mRNA反转录产生cDNA。
(2)载体DNA的选择：
①质粒：质粒是细菌染色体外遗传因子，DNA呈环状，大小为1-200千碱基对(kb)。在细胞中以游离超螺旋状存在，很容易制备。质粒DNA可通过转化引入寄主菌。在细胞中有两种状态，一是“紧密型”；二是“松驰型”。此外还应具有分子量小，易转化，有一至多个选择标记的特点。质粒型载体一般只能携带10kb以下的DN*段，适用于构建原核生物基因文库，cDNA库和次级克隆。
②噬菌体DNA：常用的λ噬菌体的DNA是双链，长约49kb，约含50个基因，其中50%的基因对噬菌体的生长和裂解寄主菌是必需的，分布在噬菌体DNA两端。中间是非必需区，进行改造后组建一系列具有不同特点的载体分子。λ载体系统最适用于构建真核生物基因文库和cDNA库。
M13噬菌体是一种独特的载体系统，它只能侵袭具有F基因的大肠杆菌，但不裂解寄主菌。M13DNA(RF)在寄主菌内是双链环状分子，象质粒一样自主制复，制备方法同质粒。寄主菌可分泌含单链DNA的M13噬菌体，又能方便地制备单链DNA，用于DNA顺序分析、定点突变和核酸杂交。
③拷斯(Cos)质粒：是一类带有噬菌体DNA粘性末端顺序的质粒DNA分子。是噬菌体－质粒混合物。此类载体分子容量大，可携带45kb的外源DN*段。也能象一般质粒一样携带小片段DNA，直接转化寄主菌。这类载体常被用来构建高等生物基因文库。
(3)DN*段与载体连接：DNA分子与载体分子连接是克隆过程中的重要环节之一，方法有：①粘性末端连接，DN*段两端的互补碱基顺序称之为粘性末端，用同一种*性内切酶消化DNA可产生相同的粘性末端。在连接酶的作用下可恢复原样，有些*性内切酶虽然识别不同顺序，却能产生相同末端。②平头末端连接，用物理方法制备的DNA往往是平头末端，有些酶也可产生平头末端。平头DN*段可在某些DNA连接酶作用下连接起来，但连接效率不如粘性末端高；③同聚寡核苷酸末端连接。④人工接头分子连接，在平头DN*段末端加上一段人工合成的、具有某一*性内切酶识别位点的寡核苷酸片段，经*性内切酶作用后就会产生粘性末端。
连接反应需注意载体DNA与DN*段的比率。以λ或Cos质粒为载体时，形成线性多连体DNA分子，载体与DN*段的比率高些为佳。以质粒为载体时，形成环状分子，比率常为1∶1。
(4)引入寄主细胞：常用两种方法：①转化或转染，方法是将重组质粒DNA或噬菌体DNA(M13)与氯化钙处理过的宿主细胞混合置于冰上，待DNA被吸收后铺在平板培养基上，再根据实验设计使用选择性培养基筛选重组子，通常重组分子的转化效率比非重组DNA低，原因是连接效率不高，有许多DNA分子无转化能力，而且重组后的DNA分子比原载体DNA分子大，转化困难。②转导，病毒类侵染宿主菌的过程称为转导，一般转导的效率比转化高。
