做荧光定量时 扩增曲线和溶解曲线都很好 没有出现二聚体 但是...7
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发布时间：2023-10-22 10:06
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热心网友
时间：2024-08-16 02:27
朋友，首先跟你说一下我的经验，其实这里有个误区，其实普通PCR对Realtime PCR的指导意义实在是太小，因为realtime PCR的引物跟普通PCR的引物有很大差别，realtime PCR的引物因为要顾及试验体系的要求，所以在引物性能方面有一些牺牲，比如有时候要求180-200bp的扩增需要会牺牲一些性能，比如存在二聚体之类的东西。溶解曲线没有明显的峰说明没有扩增产物，这里面问题很多，比如温度条件、引物条件等等，最好还是能够找公司帮你设计引物，比如takara等公司，可以帮你设计引物。再有一个问题，你说你的模板稀释倍数越来越小依然没有产物，你觉得困扰，其实并不是像你想的那样，按照你的思路，你扩增产物应该是丰度比较低的产物，这样的扩增反应你认为模板量越大越好，其实不然，因为反转录buffer和realtime buffer是不同的，而且反转录体系的一些组分能够抑制realtime反应的进行，因此，可能你稀释倍数越低，最后反而realtime反应的扩增效率越低，你可以尝试把稀释倍数高一些试试看，因为当时我在做实验的时候确实在丁香园上看到有的战友提到过这样的问题，如果再有问题我们可以再讨论，大家一起提高，希望能帮到你。如果回答对您有用，请及时采纳。
热心网友
时间：2024-08-16 02:24
也许量本来就很低？
热心网友
时间：2024-08-16 02:24
朋友，首先跟你说一下我的经验，其实这里有个误区，其实普通PCR对Realtime PCR的指导意义实在是太小，因为realtime PCR的引物跟普通PCR的引物有很大差别，realtime PCR的引物因为要顾及试验体系的要求，所以在引物性能方面有一些牺牲，比如有时候要求180-200bp的扩增需要会牺牲一些性能，比如存在二聚体之类的东西。溶解曲线没有明显的峰说明没有扩增产物，这里面问题很多，比如温度条件、引物条件等等，最好还是能够找公司帮你设计引物，比如takara等公司，可以帮你设计引物。再有一个问题，你说你的模板稀释倍数越来越小依然没有产物，你觉得困扰，其实并不是像你想的那样，按照你的思路，你扩增产物应该是丰度比较低的产物，这样的扩增反应你认为模板量越大越好，其实不然，因为反转录buffer和realtime buffer是不同的，而且反转录体系的一些组分能够抑制realtime反应的进行，因此，可能你稀释倍数越低，最后反而realtime反应的扩增效率越低，你可以尝试把稀释倍数高一些试试看，因为当时我在做实验的时候确实在丁香园上看到有的战友提到过这样的问题，如果再有问题我们可以再讨论，大家一起提高，希望能帮到你。如果回答对您有用，请及时采纳。
热心网友
时间：2024-08-16 02:30
也许量本来就很低？
