发布网友 发布时间:2024-07-02 18:12
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热心网友 时间:2024-07-11 05:19
深入探索 Western blot 这一科学瑰宝,你是否好奇它的魔力?蛋白质免疫印迹,或简称 Western blot,是生物实验中不可或缺的工具,它通过精密步骤揭示组织和细胞中蛋白表达的秘密。首先,让我们走进这个过程的核心——从提取蛋白开始,这并非易事,尤其是组织蛋白,需要细致的预实验来排除干扰因素,务必在低温环境中操作,以保护宝贵的生物活性。细胞蛋白的提取则相对简洁,但同样需要准确的浓度测定,BCA 测定法在此大显身手,配合变性与loading buffer,为蛋白的电泳之旅做好准备。
电泳是Western blot的灵魂,根据目标蛋白的分子量选择合适的胶,marker的选择同样至关重要。浓缩胶,凭借其大孔隙结构,确保蛋白质均匀混合并充分迁移,随后通过调整电压来完成分离。转膜,湿转以其普遍适用性和高效性脱颖而出,尤其在220V、300mA的条件下,1小时20分钟内即可完成,但转膜液的新鲜度和蛋白特性需密切留意。
当蛋白质成功定位在膜上,ECL发光技术登场,通过1:1混合A液和B液,新鲜的发光液能带来更佳的可视化效果,根据蛋白信号的强弱,调整发光时间。至于后续的数据处理,Photoshop和ImageJ是你的得力助手,前者调整条带对比度,后者则通过测量蛋白灰度值,帮助校正BCA浓度可能的误差,确保数据的准确性。
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