...Group生物光子学讲义(三):显微镜基础、明场、暗场、像衬、荧光显微...
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发布时间：2024-06-03 14:45
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时间：2024-06-23 11:07
深入探索光子成像技术的奥秘：显微镜世界
上一课揭示了光与物质互动的基石，今天我们将踏上光子成像技术的探索之旅，深入解析其原理与基础。从传统显微镜到现代科技的突破，光学技术犹如一部多元化的交响乐，包括传统显微术、定量相位成像、光学工具，以及近场显微术、激光点扫描、远场超分辨率和三维显微术，特别是多光子显微术，它在三维成像领域独树一帜。
传统显微镜的构造由物镜和目镜组成，而现代显微镜引入了无限矫正系统，为光学设计提供了更大的灵活性。物镜的NA（数值孔径）决定分辨率，然而，追求高分辨率与广角视野之间常常是一场微妙的平衡。突破传统局限的尝试包括超大型透镜或精密的拼接技术，但代价可能是体积的增加或复杂性的提升。
在光学世界的挑战中，电动平移台（价格不菲，超过十万人民币）和样本的微小漂移可能导致图像伪影。光学系统的局限性要求我们在分辨率和视野之间做出抉择。生物样品的无色透明性在明场显微镜下造成低对比度，关键的相位信息往往隐藏其中，而现有相机往往无法有效捕捉。
解决低衬度问题的传统手段，如化学染料，虽能改善图像，却伴随着制备时间长和光毒性的问题。荧光标记技术，如绿色荧光蛋白（GFP），无疑是一次飞跃，但其潜在问题也需警惕。未来，无标记技术的兴起无疑将引领新的潮流。
在相位成像领域，泽尼克像衬和微分干涉像衬是定性的手段，而数字全息显微术则能提供定量的相位信息，但对环境稳定性提出了较高要求。非干涉技术如Shack-Hartmann传感器和TIE也各有其局限性。科学家们正在寻求无透镜成像技术，如相干衍射成像（CDI）和光流控，以减少光学系统带来的像差问题，尽管物镜的存在使得这些技术的吸引力有所受限。
片上显微技术尽管有其局限性，如样品选择和应用场景的清晰定义，但傅里叶叠层显微成像术（FPM）通过LED阵列和低分辨率物镜，实现了大视场和合成孔径的结合，提供了高分辨率的相位图像。显微镜按照功能可分为倒置和正置，服务于生物、金相、体视和荧光等多个领域。明场和暗场成像的对比度调整，需要精细操作聚光镜，以确保最佳图像质量。Nomarski显微镜（DIC）提供了伪三维立体效果，但对观察角度有特定要求。
荧光成像则有透射和反射模式，可用多种染料，然而分辨率和光毒性依然是关注焦点。这个领域还有许多有待挖掘的潜力和改进空间。
