受激拉曼显微镜

发布网友 发布时间：2024-05-22 18:57

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热心网友 时间：2024-08-11 15:08

近年来受激拉曼散射显微成像的技术成为热点。被称为受激拉曼散射显微成像的技术帮助外科医生在手术过程中更好的区分患者脑内的癌组织和正常组织，这可能会提高该类手术的安全性和精确性。

近期报道英国首例：成功运用激光探测和智能刀精确切除脑部肿瘤。Reuben Hill，22岁，在读博士，脑部患有肿瘤。他成功接受了一场特殊的脑部肿瘤切除手术：术中采用了两个新技术――激光探测和智能刀。作为实验室成果运用到手术室的成功案例，这场开创性手术是精确外科手术的重大改革。

脑部肿瘤对生命的威胁超过其他任何一种肿瘤，脑部肿瘤切除手术具有很大的难度，因为神经组织交错复杂，肿瘤组织又这些精密结构相连，有时候外科医生通过显微镜都很难看清楚组织结构。同时，切除癌变组织面临着很大风险，因为手术刀必须严格确保在不破坏周围的正常脑组织的前提下，把肿瘤组织切除干净。一旦切到健康组织，会导致严重的副作用，例如丧失说话、听觉等功能。新型激光探针和智能刀大大降低了上述手术风险，且能够向外科医生即时提供组织是否癌变的信息。利用激光探测区分癌变组织和健康组织，且激光能够为外科医生提供肿瘤的映射，达到精确的切除水平。

激光探针，利用拉曼光谱分子从组织中反射回来的光进行组织区分，由加拿大温哥华erisante Technology公司研发提供。Vaqas表示，这是第一次将拉曼光谱应用于人脑部手术的成功案例。

那么激光拉曼光谱技术到底还能做什么呢？癌症是威胁人类健康和生命的严重疾病之一， 早期诊断与及时治疗是提高癌症患者生存率的最有效途径。激光拉曼光谱技术Ramanspectroscopy;作为一种非侵入性的检测技术， 可以无损伤地提供丰富的分子结构特征和物质成分信息， 从分子水平上反映癌变组织与正常组织之间的结构差异， 从而可用于癌症的早期诊断cancersdiagnosis。综述了激光拉曼光谱技术在皮肤癌、鼻咽癌、肺癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌及前列腺癌诊断中的研究进展， 并对拉曼光谱技术在癌症诊断中的发展方向和应用前景作了进一步的展望， 为癌症的早期检测和诊断技术的应用研究提供参考依据。1928 年，印度物理学家Raman 在研究中发现了拉曼散射的存在，此后研究人员对这一技术做了深入的研究，但是因为光源的*使该技术未能得到广泛应用。直到60 年代激光问世后，拉曼光谱信号弱的弱点才被彻底攻克，拉曼光谱如虎添翼得到了长足的发展，使其广泛应用于科学研究之中，自此之后激光光源也一直都是拉曼光谱的理想光源。直到1974 年，英国科学家Fleischmann 在研究吡啶的拉曼光谱时才发现通过某种方式是可以增强待测物的拉曼信号的，但是他们并没有进一步探讨其增强机制。SERS 技术的真正发现还要追溯到1977 年，这一年，Van Duyne 和Jeanmaire等系统地研究了与Fleischmann 研究小组相同的体系后，才发现吸附在粗糙Ag 表面上的吡啶的拉曼散射信号与溶液相中的同数量的吡啶拉曼散射信号相比，增强了约6 个数量级，正是这一发现之后人们才把这一增强现象称为SERS。

随着医学检测和诊断技术的不断提高， 癌症的早期临床诊断也取得了迅速发展。但多数情况下仍需采用活组织切片进行诊断， 这些方法侵入性强、对患者损伤较大， 检测速度慢、并可能引起癌细胞扩散， 而且需要检测人员具备一定的病理学知识。为解决上述问题， 研究人员一直在不断进行新的检测分析技术的研究和尝试， 以实现对癌症进行快速的非侵入性的早期临床诊断。激光拉曼光谱技术作为一种非侵入性的检测技术， 可以提供丰富的分子结构特征和物质成分信息， 通常被称为物质的分子指纹（molecularfingerprints），可望在分子水平上实现无损检测。与传统的医学诊断方法相比， 拉曼光谱检测技术具有非破坏性、非侵入性noninvasivedetection、分辨率高、不用试剂和高度自动化等优点。因此， 拉曼光谱技术在医学检测和诊断领域的应用倍受人们的重视。

在肿瘤生长和发展过程中，组织细胞内的物质结构、构象和数量会发生明显变化，拉曼光谱可以对这些信息变化实现高灵敏度、高分辨率的检测，进而在分子水平上揭示癌变组织与正常细胞组织结构之间的差异，通过对比研究癌变组织和正常组织的拉曼光谱，从二者的差异可发现能反映组织病变信息的特征光谱，因此，拉曼光谱检测技术对实现癌症的早期诊断和及时治疗，从而提高癌症患者的生存几率，具有重要意义。本文综述了拉曼光谱技术在多种癌症检测和诊断中的应用及研究进展，并对拉曼光谱技术在此领域的应用前景作了进一步的展望，期望为癌症的早期检测和诊断技术的应用研究工作提供参考信息和指导。

1、拉曼光谱技术在癌症检测和诊断中的应用研究

1.1皮肤癌的拉曼光谱检测皮肤癌

主要有三种类型：基底细胞癌（basalcellcarcinoma, BCC）、鳞状细胞癌（squamouscellcarcinoma,SCC）和恶性黑素瘤（melanoma, MM），其中基底细胞癌最为常见。基底细胞癌和鳞状细胞癌若得到及时治疗，几乎所有病例均可治愈，而恶性黑素瘤是最少见但最严重的皮肤癌，若不能及时治疗，则会导致死亡。但是由于这几种癌的症状很相似，所以在诊断过程中存在一定困难，而将病人组织的每一块色素都切除进行活检是不可行的，因此需要寻求一种非侵入性的、无创伤的检测诊断方法。Nijssen等采用近红外激发光源，获得了基底细胞癌组织、真皮组织、上皮组织的拉曼光谱，利用多元统计分析和聚类分析对光谱进行分析，建立了组织分类模型，该模型可以鉴别癌变组织及其周围的非癌变组织，灵敏度达100，特异性可达93。他们的研究证实拉曼光谱能够准确地确定肿瘤的切除范围，为基底细胞癌的诊断与治疗提供了有力的理论和实验依据。Choi等利用共聚焦拉曼光谱技术对正常组织和基底细胞癌组织进行光谱检测研究，发现二者的光谱存在明显差异， 因此，无需对光谱数据进行统计分析，便可以将BCC组织与周围正常组织区分开。Short等研究了节状基底细胞癌肿瘤周边胶原质的变化，发现癌细胞的细胞核中核酸、组蛋白及带有机动蛋白的蛋白质的作用与其在正常表皮细胞中的作用不同。并且获得了真皮组织的拉曼光谱，发现癌细胞周围的真皮组织中，940cm-1处拉曼谱线强度增大，1210cm-1和1270cm-1处谱线强度明显减小，说明肿瘤周边组织中胶原质不仅含量低，而且结构上也发生了一定的变化。为了利用傅里叶变换拉曼光谱（FT-RS）来区分鳞状细胞癌与正常皮肤，Pereira等采用1064nm作为激发光研究了人体皮肤活检组织的拉曼光谱，发现正常组织中位于860cm-1和939cm-1处的拉曼谱线强度明显比癌变组织中的相应光谱强度高，并且在1 555cm-1～1560cm-1波数范围内，归属于核酸的谱线强度也有所不同。Gniadecka等利用近红外傅里叶变换（NIRFT）拉曼光谱研究了黑素瘤与其他皮肤病变的拉曼光谱特征，发现恶性黑素瘤的蛋白质酰胺Ⅰ带强度减小，而脂质特征峰强度增大。并利用神经网络方法进行光谱分析，使得拉曼光谱对恶性黑素瘤诊断的灵敏度和特异性分别达到了85和99。Huang等利用近红外拉曼光谱（NIR-RS）成功地获得了皮肤黑色素的在体拉曼光谱图，分析光谱发现黑色素的拉曼光谱分别在1580cm-1和1380cm-1处存在强度较高、频带较宽的拉曼谱带，分别属于芳香环的平面振动和C-C的伸缩振动模式。利用拉曼光谱技术在活体条件下获得了黑色素的光谱信号，表明拉曼光谱可能成为对皮肤进行原位分析与诊断的一种十分有效的临床检测方法。拉曼光谱技术还可用于其他皮肤病的检测中。Cheng等采用显微拉曼光谱技术分析了人类皮肤毛基质（humanskinpilomatrixoma, PMX）中构象与化学成分的变化，发现正常皮肤与软PMX组织和硬PMX组织的拉曼光谱存在明显区别，尤其是1 665cm-1归属于酰胺Ⅰ的特征峰移到1655cm-1处，硬PMX组织的拉曼光谱中归属于酰胺Ⅲ的特征峰强度明显减小。这些结果均表明显微拉曼光谱能够有效区分正常皮肤组织、软PMX组织及硬PMX组织。而且拉曼光谱分析技术在识别不同的皮肤病变方面具有很高的精确度，特别是对癌变组织具有很好的识别能力，在恶变肿瘤的原位分析与诊断中具有巨大的潜在应用价值。

1.2鼻咽癌和肺癌拉曼光谱检测

Lau等用拉曼光谱仪检测了鼻咽部的活检标本，每个光谱的采集时间仅为5s。分析发现在1290cm-1～1320cm-1及1420cm-1 ～1470cm-1波数范围内癌变组织的拉曼谱线强度比正常组织中相应谱线强度大，而1530cm-1 ～1580cm-1波数范围内，则是正常组织的拉曼谱线强度比癌变组织中相应谱线强度大。他们还利用拉曼光谱分别对喉部的正常组织、癌变组织、鳞状细胞乳头状瘤进行了研究。通过对拉曼光谱的峰值分析表明利用拉曼光谱对正常组织、癌变组织以及鳞状细胞乳头状瘤进行分析检测的灵敏度分别为89, 69, 88;特异性分别为86, 94, 94。Stone等收集了正常组织、不典型增生和癌变组织的拉曼光谱，用多元统计方法分析了光谱差异。可见的光谱区别在850cm-1～950cm-1和1200cm-1～1350cm-1谱段，核酸峰的相对强度随病变发展为恶性而增加。为了探究拉曼光谱对肺癌进行早期光学检测和诊断的可行性，Huang等利用快速弥散型近红外拉曼光谱（NIR-RS）研究了肺癌与正常支气管组织的光谱信息。研究表明，肺癌和正常支气管组织的拉曼光谱有明显区别，发现将拉曼谱线的强度比值酰胺I1 445/酰胺I1 655作为判断标准，能够有效区分肺部正常组织与癌变组织， 当酰胺I1 445 /酰胺I1 655 1 时，所检测的组织为正常组织；酰胺I1445/酰胺I1 6551 span=?时，则为癌变组织。利用此标准区分正常组织与癌变组织的灵敏度和特异性分别可达到94和92。Yamazaki等构建了一种新型近红外多通道拉曼系统（near-infraredmultichannelRamansystem），该系统用于采集肺部组织拉曼光谱，具有信噪比高、可避免荧光干扰、测量时间短（1s）等优点。利用该系统收集了210个肺癌组织和正常组织的拉曼光谱，灵敏度达与特异性分别达到91 和97。Min等利用近红外多通道拉曼光谱仪对未经任何处理的肺部组织进行研究，分别采用785nm和1064nm作为激发光， 结果表明采用785nm作为激发光时，背景荧光很强检测不到拉曼谱线，而用1064 nm光源激发时，得到了信噪比很高的拉曼光谱。因此对未经处理的肺部组织进行拉曼光谱分析研究时，通常应采用1064 nm作为激发光源。Li等研究了在肺癌发展过程中血清的荧光光谱及拉曼光谱的变化，采用488nm和514.5nm作为激发光对一组癌症患者的血清每周进行一次检测，研究发现，癌症发展的不同时期荧光光谱没有明显变化，而属于β胡萝卜素的三个拉曼峰（分别位于539nm、544nm及556nm处）强度减小，最后消失。该实验结果表明，在肺癌恶化的过程中，β胡萝卜素的含量逐渐减少，可将此作为诊断肺部是否癌变的依据。

1.3胃癌和结肠癌的检测

凌晓锋等利用傅里叶变换拉曼（FT-Raman）光谱研究了40例胃癌与胃部正常组织，对光谱进行统计处理后发现，酰胺I3 240/酰胺I2940,酰胺I1660 /酰胺I1450,酰胺I1080 /酰胺I1450在胃癌组织中明显升高（3240 cm-1,2940 cm-1,1660 cm-11450cm-1,1080cm-1分别是蛋白质N-H及水的OH伸缩振动、脂类中C-H的伸缩振动、蛋白质酰胺Ⅰ带和水的H-O-H变角振动、CH3或δCH2 、核酸中PO的伸缩振动的特征峰位置）。因此可以将这些特征作为判别组织是否癌变的依据之一。唐伟跃等采集了胃窦部正常组织和癌变组织的拉曼光谱， 结果表明在癌变组织的拉曼光谱中，1089cm-1线比正常组织的相应谱线明显增强，而且1459cm-1线发生*。通过这些信息的提取，可望为肿瘤组织的检测分析提供判断依据。为了检测胃肠癌细胞与正常细胞的区别，Yan等利用共聚焦显微拉曼光谱研究了胃肠癌病人单个细胞。结果表明，在癌细胞中，1002cm-1处属于苯丙氨酸的谱线半宽度变窄，白细胞的谱线强度小并且谱线少，而红细胞的谱线强度大而且谱线丰富，并且在1620cm-1～1540cm-1范围内存在吡咯环CN呼吸伸缩振动的谱线。胃癌细胞的拉曼光谱与正常细胞的拉曼光谱相似，但谱线强度减弱，而且有的谱线消。Huang等利用近红外拉曼光谱仪开展研究，将恶性肿瘤与正常组织及良性肿瘤区分开，通过对105个结肠样本进行拉曼光谱检测，在离体条件下采集到800cm-1～1800cm-1波数范围内高分辨率的拉曼光谱图，分析发现正常组织与癌变组织的光谱差异，并以1002cm-1与1445cm-1谱线的强度比为横坐标，1085cm-1与1445cm-1谱线的强度比为纵坐标建立了诊断算法，此算法识别恶性肿瘤与正常、良性组织的灵敏度达100,特异性达96.6。Chen等将激光光镊技术与拉曼光谱技术相结合，研究了上皮癌的单个细胞，对收集到的光谱进行主成分分析，再进行对数回归得到能够最有效区分癌细胞与正常细胞的参数方程。此诊断模型总的灵敏度为82.5，特异性为92.5。此项研究从对上皮癌的诊断到对致癌作用的细胞动力学的研究均有很大的应用价值。Yan等的研究发现，肠癌细胞拉曼谱线强度很弱而且很多谱线消失，并且癌细胞内不同位置的荧光强度不同。这表明拉曼光谱技术能够为肠癌的早期检测和诊断提供一种有效手段。

1.4拉曼光谱在乳腺癌检测中的研究

Haka等用拉曼光谱技术分析了乳腺良恶性病变中微小钙化的化学组成，将之分为Ⅰ型草酸钙和Ⅱ型羟基磷灰石。Ⅰ型诊断为良性，Ⅱ型既有良性也有恶性。通过对拉曼光谱进行主成分分析可区分Ⅱ型微小钙化的良恶性，灵敏度和特异性分别达88和93。Haka等还利用线性组合模型，将脂肪和胶原质的拟合系数作为参数，对正常的、纤维癌、浸润癌等组织的130个拉曼光谱图进行识别，得到了灵敏度为94、特异性为96的诊断模型。Bitar等利用傅里叶变换拉曼光谱FT-RS研究正常乳腺组织及包括不同癌症亚型的癌变乳腺组织。比较不同组织的拉曼光谱中特征峰的强度变化，可以将正常组织、纤维囊性组织、原位导管癌、出现坏死组织的原位导管癌、浸润性导管癌、胶原浸润性导管癌、浸润性小叶癌等7种不同组织区分开。赵元黎等利用显微共聚焦拉曼光谱仪检测了40例手术切除乳腺肿瘤周边（肿块边约5 mm）组织的拉曼光谱。研究表明，在不同性质的乳腺肿块周边组织的拉曼光谱中，1440/1530和1082/1156具有可分性，分别以1.25和1.03作为界线可以对检测目标进行识别分类。闫循领等研究了乳腺癌病人正常乳腺细胞与癌细胞的拉曼光谱。观察谱线得到癌变细胞的拉曼谱线整体变弱，归属于DNA的两个磷酸骨架峰782cm-1，1084cm-1和脱氧核糖-磷酸振动峰1155cm-1及1262cm-1谱线明显减少；表征A型（DNA）构象的特征峰812cm-1及979cm-1，668cm-1消失，并有新峰1175cm-1出现，905cm-1的谱线增强并有6cm-1的红移，这说明DNA的磷酸骨架有一定的断裂，从而导致癌细胞的*繁殖失去有效控制。在癌变组织细胞的拉曼光谱中还发现了很强的一类与钙硬化密切相关的特征峰960cm-1 。这些研究工作为乳腺癌的早期检测和诊断提供了有力的实验依据。

1.5前列腺癌的光谱检测

Crow等利用拉曼光谱技术在离体条件下检测了良性前列腺增生和恶性前列腺癌的活检组织，分析发现前列腺癌组织与良性前列腺增生组织相比，糖原的浓度减小，而核酸的浓度增大。并且利用主成分分析构建了线性判别模型对不同时期的癌变组的拉曼光谱进行识别，从而实现了对前列腺癌的分级。Crow等又研究了四种不同的前列腺细胞系（LNCap，PCa2b；DUI45, PC3）， 采用三个主成分PC1、PC2和PC3，建立了PCA/LDA诊断算法。PC1代表核酸（721cm-1 、783cm-1 、1305cm-1 、1450cm-1、1577cm-1）、DNA骨架（827cm-1、1096cm-1）和无序蛋白质（1250cm-1、1658cm-1）增加的浓度；PC2代表蛋白质α-螺旋（935cm-1、1263cm-1、1657cm-1）和磷脂（719cm-1、1094cm-1、1125 cm-1、1317cm-1）减小的浓度；PC3代表脂质（1090cm-1、1302cm-1、1373cm-1）、糖原（484cm-1）和核酸（786cm-1、1381cm-1、1576cm-1）减小的浓度。当PC3的值大而PC2的值小于或等于0时，可将DUI45, PC3两种细胞系识别出来。而当PC2的值大于0，PC3小于或等于0时，可将LNCap，PCa2b两种细胞系识别出来。

2、拉曼光谱在肿瘤检测中的应用前景

拉曼光谱技术是一种非破坏性、非侵入性、分辨能力高的检测方法，在癌症诊断中已经初显其优势。但其信号弱、易受背景荧光干扰等缺点*了拉曼光谱技术的应用。但各种拉曼光谱技术例如时间分辨拉曼光谱技术、傅里叶变换红外拉曼光谱技术等的应用以及研究的不断深入，可有效地克服存在的局限，使其能够在生物医学领域得到更广泛的推广和应用。随着激光光镊技术以及共聚焦显微技术的发展，实现了单细胞水平上对癌变组织的诊断，有望揭示癌变的机理，从而为癌症的诊断建立更为有力的实验基础。光纤技术的引入，能够直接对皮肤等多种组织进行实时、原位测量， 既可以减小给患者带来的危害，又可以实现实时、有效的诊断， 提高患者的生存几率。总之，随着样本研究的积累，研究方法和设备的改进、统计模型的优化、各种技术与拉曼光谱技术的完美结合，拉曼光谱技术必然会从实验研究转向临床诊断应用，必将在癌症的研究与临床诊断中得到广泛的应用。