WB蛋白电泳实验步骤,液体的配置及相关问题解答
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发布时间：2024-04-17 14:39
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时间：2024-04-17 17:25
深入探讨WB蛋白电泳实验：步骤详解与常见问题解答
Western Blot，简称WB蛋白印迹法，是科研领域中不可或缺的实验手段。以下是一份详细的电泳液配置和实验步骤，以及常见问题的解答，希望对您的实验工作提供有力支持。
1. 试剂配置与选择
电泳液:以100ml为基准，准备Tris 3.03g, 甘氨酸 18.8g, SDS 1g。
转膜液:Tris 3.03g, 甘氨酸 14.4g, 800ml ddH2O和200ml甲醇混合。
TBST(10×):Tris 12.1g, NaCl 40g, 500ml ddH2O。
2. 实验步骤详解
a. 配制和制胶
使用雅酶配胶盒，根据样本选择胶浓度：7.5%（30kDa以上）、10%（20-150kDa）、12.5%（50kDa以下）。
确保玻璃板清洁，倒入AB液（1:1），加入促凝剂，再加压胶液，静置15分钟以上。
b. 电泳
安装胶板，确保电泳槽无泄漏，加入样本和marker，设置电压120V，预实验确定时间（60分钟）。
上样时小心注入，初次推荐10ul，后续根据需要调整。
c. 转膜（湿转）
选用PVDF膜（4cm宽，10-15口），浸入转膜液，调整好转膜夹和位置。
转膜电流200mA，时间根据不同分子量调整（75kDa以下120分钟，75kDa以上180分钟）。
d. 封闭与切膜
封闭液根据具体试剂选择，切膜时注意保护条带，适当调整切片范围。
e. 一抗与二抗
一抗过夜或室温孵育，二抗同理，根据蛋白表达量灵活调整孵育时间。
3. 常见问题解答
问题1: 背景过深?有可能是一抗问题，建议更换封闭液、一抗或适当调整孵育时间。
问题2: 条带不出?表达量低、一抗问题或试剂问题，尝试降低稀释比、提供样本蛋白浓度或换一抗。
问题3: 内参不齐?分别在每口加样，如C样本灰度最低，调整A或B的加样量。
在实验过程中遇到任何疑问，欢迎在“科研区域”公共号留言，我们将竭诚为您解答。
