如何配置半胱氨酸中巯基含量的标准曲线
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发布时间：2024-01-14 01:43
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热心网友
时间：2024-01-14 18:10
1. 准备试剂：半胱氨酸（Cys）、DTNB（Ellman's reagent）、Tris-HCl缓冲液（0.25M）、甲酸等。
2. 准备样品：准备不同浓度的半胱氨酸溶液，可以用甲酸溶解。
3. 配置标准曲线：分别取0、0.5、1、2、3、4、5μmol的Cys与10mMDTNB标准液（0.1mM）混合，加入适量Tris-HCl缓冲液（0.25M），使总体积为5ml。这样就可以得到一系列不同浓度Cys与DTNB反应的溶液。
4. 巯基含量测定：将上述溶液在37℃水浴中放置30min后，用分光光度计在412nm波长处测定各溶液的吸光度。
5. 绘制标准曲线：以吸光度为纵坐标，Cys浓度为横坐标，绘制标准曲线。
6. 样品巯基含量测定：将样品与DTNB反应后，同样方法测定吸光度，然后根据标准曲线计算巯基含量。
注意事项：实验过程中要避免试剂接触到皮肤和眼睛，如果不慎接触到，应立即用大量清水冲洗，并及时就医。另外，实验操作需要在通风橱中进行，以防止试剂对呼吸系统造成刺激。
热心网友
时间：2024-01-14 18:10
DTNB为Ellman试剂。它用于比色法测定生物样 品中巯基。它易溶于水。在巯基化合物的存在下，无色的DTNB将被转变成黄 色的5-巯基-2-硝基苯甲酸。由于5-巯基-2-硝基苯甲酸在412 nm处具有最大吸收，DTNB的吸收光谱并不干扰巯基的测定。
配置方法：
准确称取0.198gDTNB用50mMNa2HPO4（pH＝7.0）配制成50ml溶液，存放于棕色瓶中，于暗处低温保存备用。应该注意的是配置缓冲、浓度，储存时要避免见光。
应用举例：
半胱氨酸中自由巯基的定量检测方法
一、试剂的配制：
1、Tris－HCL缓冲液（0.25M）：DDW准确配制后，用盐酸调节pH＝8.3；
2、半胱氨酸标准溶液（1mM）：准确称取0.017563gL－半胱氨酸（175.63），用1ml甲酸溶解，以DDW定容至100ml；
3、DTNB（分子量：396.35）标准溶液（10mM）：准确称取0.198175gDTNB用50mMNa2HPO4（pH＝7.0）配制成50ml溶液，存放于棕色瓶中，于暗处低温保 存备用
4、DTNB分析溶液（0.1mM）：由1体积10mMDTNB标准液加99体积0.25M的Tris缓冲液配制而成，现用现配。
二、标准曲线的制作;
1、25℃条件下，用Tris缓冲液稀释半胱氨酸标准液配成梯度的稀释液（5.0ml）， 其浓度分别为：0.00mM、0.025mM、0.05mM、0.1mM、0.15mM、0.2mM；
2、取上述各浓度溶液1ml分别加入到5ml预先恒温于25℃水中的DTNB分析溶液，摇匀，准确静止10min，立即于波长412nm处测定吸光度值（A）。
根据目的蛋白的吸光度在标准曲线上读出对应的浓度即可
Proct Name:DTNB
Proct Number:D8130
Proct Brand:Sigma
CAS Number:69-78-3
Molecular Formula:[-SC6H3(NO2)CO2H]2
Molecular Weight:396.35
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