...之一:单细胞RNA测序中质控之重要细节 (下篇)

发布网友发布时间：2024-01-10 05:10

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热心网友时间：2024-10-31 03:15

单细胞RNA测序是目前的一大热门。通过单细胞RNA测序，能够带给我们原来 bulk RNA 测序所得不到的信息，对于研究发育生物学，肿瘤生物学，免疫等有着极其重要的价值。

单细胞测序的核心就是t-SNE降维，以及聚类。那么在做这些工作之前的质控，关乎到整个分析的成败。这篇文章我就继续给大家讲讲单细胞质控的那些事儿。

整个单细胞分析的核心其实就是确定cell types/ lineages。而在此之前的一步就是数据质控(QC, quanlity control)。我们在得到表达矩阵之后，会做Data normalization , 基因集筛选，批次效应的去除等工作；之后用PCA， t-SNE进行降维。如果在这一过程中发现了一些问题，我们会移除掉一些细胞，然后重新质控，降维分析。

一般而言，检查点有如下一些：

比对率比较低或者reads数较少有可能是建库原因。reads数较少可能与形成较多的primer dimer有关，而比对率低通常是建库的原因。

如果spike-in RNA序列很少，那么就可以直接说明是建库失败。如果spike-in 正常，但细胞RNA序列较少，可能是因为这个细胞本身就非常小，或者细胞在建库前出现了破损。

检测出基因的数量与细胞大小直接相关。如果检测出的基因（UMI）过多，很有可能是这个droplet里面有多个细胞，但是也不能排除是这个细胞就是非常的大。如下图，基因数目过多或者过少，都是不正常的情况。

通常而言，细胞大小、spike-in RNA比例与检测出的基因数往往是正相关的，如下图。

如果线粒体RNA过高，也同样预示着细胞有破损。因为当细胞破损时，细胞质RNA会跑出来，但是线粒体RNA由于有线粒体膜的包裹，不会溢出。因此，当细胞膜有破损时，线粒体RNA所占比例会很高。注意：当细胞出现apoptosis, necrosis的时候，也会有这种现象。

核糖体RNA占比较高时，可能是因为细胞内出现了较多的RNA降解。在全长单细胞转录组中，3’ 偏好性可用于检测细胞内是否存在大量RNA降解。

在上图中，我们对细胞中基因的数量、唯一比对率、基因body比对率、spike_detection等绘制分布图，然后剔除不合格细胞，将能够通过上述所有质控标准的细胞保留下来、用于后续分析。

基于PCA这一算法也可以进行质控，找到明显没有与其他细胞聚到一起的细胞。这些细胞被认为是质控不达标的细胞，如下图所示。

我们已经有了这么多方法和指标去过滤细胞，那么我们需要注意一些什么呢？

接下来就是要讨论如何过滤基因，对于绝大多数情况，我们不会用所有的基因去进行降维分析，所以需要进行基因集合的选取。

基因集的设定是基于：

（1）表达量高于一定阈值的基因
（2）在整个细胞样本中存在差异变化的基因
（3）用先验的知识去挑选基因
（4）bulk RNA测序中已经鉴定出来的差异基因。
（5）t-SNE降维时只选取前几个PC

有些时候，有些基因的表达异常高，这对后续数据的Normalization带来影响，有时也会考虑过滤掉。比如nulcear lncRNA ,、actin,、hemoglobin,、线粒体RNA和核糖体RNA。

有一些基因要根据情况需要进行移除，以下三点要根据课题情况来决定是否保留或者去除。

单细胞RNA测序最棘手的就是批次效应（batch effect）。 batch effects 可以发生在：

不同批次的样品或许采用的质控标准也应该不一样，通过PCA的结果，可以查看结果中是否有明显的批次效应。