植物基因组DNA提取怎么做?
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发布时间：2022-05-05 00:58
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时间：2022-06-28 00:56
一、材料
幼嫩叶子。
二、设备
移液器，冷冻高速离心机，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，50ml离心管（有盖）及5ml和1.5ml离心管，弯成钩状的小玻棒。
三、试剂
1、提取缓冲液Ⅰ：100mmol/L
Tris·Cl,
pH8.0,
20mmol/L
EDTA,
500mmol/L
NaCl,
1.5%
SDS。
2、提取缓冲液Ⅱ：18.6g葡萄糖，6.9g二乙基二硫代碳酸钠，6.0gPVP，240ul巯基乙醇，加水至300ml。
3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇
4、
RnaseA母液
5、其它试剂：液氮、异丙醇、TE缓冲液，无水乙醇、70%乙醇、3mol/L
NaAc。
四、操作步骤：
1.
在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液Ⅰ,
60℃水浴预热。
2.
幼苗或叶子5-10g,
剪碎,
在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中,
剧烈摇动混匀,
60℃水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高),
不时摇动。
3.
加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液,
颠倒混匀(需带手套,
防止损伤皮肤)，室温下静置5-10分钟,
使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。
4.
室温下5000rpm离心5分钟。
5.
仔细移取上清液至另一50ml离心管,加入1倍体积异丙醇,混匀,室温放置片刻即出现絮状DNA沉淀。
6.
在1.5ml
eppendorf中加入1ml
TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,在干净吸水纸上吸干,转入含TE的离心管中,DNA很快溶解于TE。
7.
如DNA不形成絮状沉淀,则可用5000rpm离心5分钟,
再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀,往往难溶解于TE,可在60℃水浴放置15分钟以上，以帮助溶解。
8.
将DNA溶液3000rpm离心5分钟,
上清液倒入干净的5ml离心管。
9.
加入5μl
RNaseA(10μg/μl),
37℃
10分钟,
除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。
10.
加入1/10体积的3mol/L
NaAc及2×体积的冰乙醇,混匀,-20℃放置20分钟左右,DNA形成絮状沉淀。
11.
用玻棒捞出DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再在干净吸水纸上吸干。
12.
将DNA重溶解于1ml
TE,
-20贮存。
13.
取2μl
DNA样品在0.7%
Agarose胶上电泳,
检测DNA的分子大小。同时取15μl稀释20倍,
测定OD260/OD280,
检测DNA含量及质量。
[注意]
5g样品可保证获得500μg
DNA,
足供RFLP、PCR等分析之用。
