基因定位诱变是啥呀
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发布时间：2022-05-02 23:32
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时间：2022-06-28 09:16
1 局部随机掺入法
将待突变的靶基因克隆在一个载体质粒的特定位点上，其上游紧接着两个酶切位点RE1和RE2，它们分别能产生5’和3’突出的单链粘性末端。用大肠杆菌核酸外切酶III末端特异性降解经RE1和RE2双酶切开的重组质粒3’凹端，并通过酶解反应时间控制新生成的单链区域大小（单链区域越短，突变精度越高）。终止反应后，单链区域用Klenow酶补平，底物除四种正常的dNTP外，还包括一种特殊结构的脱氧核糖核苷酸类似物，在缺口填补过程中，该类似物掺入到DNA链的一处或多处。随后再用S1核酸酶处理单链末端，并以T4-DNA连接酶连接成环。重组分子转化大肠杆菌，在体内复制过程中，由于类似物的碱基配对非特异性，50%的扩增产物分子内部引入了错配碱基，并导致位点突变。由这种方法产生的突变体一般含有几对取代碱基，而突变的区域则取决于外切酶III末端降解的程度。
2 碱基定点转换法
能导致碱基定点转换的最简单方法是使用某些化学试剂在体外诱变DNA分子。通常将质粒DNA或待突变DN*段用诱变剂处理后，转化大肠杆菌，构建突变体文库。最常见的体外诱变剂为亚硫酸氢钠，在DNA单链的情况下，它能特异性地使胞嘧啶残基脱氨形成尿嘧啶残基。处理后的DNA单链再由DNA聚合酶体外转化为双链结构，在复制过程中，原DNA分子上的CG碱基对便转换成TA碱基对。从表面上看这种方法所引入的突变并非定点，但如果合适地控制诱变剂的处理条件，便能做到每个DNA单链分子只含单一转换的碱基，而且其位点随机分布，这样即可在样本庞大的突变体文库中挑选出在期望位点上突变的重组分子。
除了上述化学诱变外，还可以借助于酶促合成对DNA分子进行所有可能的碱基对转换。其原理是使单链DNA在不理想的反应条件下进行体外复制，如较高或较低的离子强度、不平衡的四种核苷酸底物浓度以及缺少从3’至5’核酸外切活性的DNA聚合酶（Taq）等。在体外DNA聚合反应系统中，如果某种核苷酸底物浓度过低，当模板要求该底物时便有可能为其它三种底物所取代，从而导致序列突变。
3 部分片段合成法
如果在待突变的位点上下游含有合适的*性内切酶识别序列，尤其当多个待突变位点集中分布在该区域时，可考虑直接化学合成这一片段，在此过程中将欲突变的碱基设计进去，然后以此人工合成的寡聚核苷酸片段置换重组质粒上对应的待突变区域，即可完成基因的定点突变。部分片段合成法特别适用于系统改变功能蛋白的氨基酸序列，并在体内观察突变位点对蛋白质生物功能的影响，从而确立突变前这些氨基酸残基对蛋白质结构和功能的贡献。例如，在大肠杆菌噬菌体433和P22阻遏蛋白分子中，-螺旋-转角--螺旋结构域与操作子DNA的结合特性就是用上述方法研究的。
4 引物定点引入法
引物定点引入法实质上是一种寡聚核苷酸介导的定点诱变方法，它能在克隆基因内直接产生各种点突变和区域突变。首先将待突变的目的基因克隆在M13-RF DNA载体上，转化大肠杆菌，挑选重组噬菌斑，从中分离出重组DNA正链；人工合成与待突变区域互补的寡聚核苷酸引物，并在此过程中设计引入突变碱基，然后在较温和条件下与重组DNA正链退火，经DNA体外复制和连接后，双链分子重新转化大肠杆菌；以上述合成的寡聚核苷酸片段为探针，在严格条件下（如将杂交温度提高5-10℃）杂交筛选含有突变碱基的噬菌斑，从中分离纯化出RF DNA双链分子进行克隆表达。相似地，若要在DNA特定位点上插入或缺失一段，也可设计合成特殊结构的寡聚核苷酸引物，并将之引入待突变区域。但须注意的是欲插入或缺失的DN*段应小于引物本身的长度，否则退火操作相当困难。
从理论上来讲，在DNA体外复制并克隆后，携带突变碱基的噬菌斑应为重组噬菌斑总数的一半，但由于技术上的原因，这种期望的噬菌斑通常只有1～5%。为了特异性富集突变体便于筛选，可将待突变的重组M13-RF DNA分子首先转化具有t和ung两个DNA代谢酶基因缺陷的大肠杆菌受体菌株。前者由于不能合成dUTP水解酶，致使细菌细胞内dUTP含量急剧上升，在DNA体内复制时，dUTP部分取代dTTP掺入到DNA新生链中；后者为尿嘧啶糖基化酶基因缺陷，这种变异株丧失了切除DNA链中脱氧尿嘧啶核苷酸残基的能力。由该菌株产生的重组M13 DNA正链分子中大约有1%的T为U所取代，经体外复制后，再将双链DNA分子导入正常的大肠杆菌受体细胞中。此时，该菌的尿嘧啶N-糖基化酶除去DNA链上的脱氧尿嘧啶核苷酸残基，使原来的模板链降解，而突变链因不含U被完整地保留下来。
5 PCR扩增突变法
将待突变的靶基因克隆在一个载体质粒上，重组分子分在含有两种不同引物的反应管A和B中。在A管内，引物I与克隆基因的区域互补，并含有唯一一个错配碱基（即突变位点），引物II则与载体区域完全互补，使得两个引物的末端位于待突变位点的右侧；在B管内，两个引物均与克隆基因互补，但引物III含有一个错配碱基，引物IV则完全互补，两个引物的末端位于待突变位点的左侧。经若干轮PCR扩增反应后，积累的双链DNA产物均为线型平头分子。将A、B两管的扩增产物混合变性并退火，只有I-III和II-IV杂合双链呈交叉缺口的环状结构且含有突变位点，这种分子不经连接可直接转化大肠杆菌，而其它组合形式的杂合双链则为线型分子，通常难以形成克隆。
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