荧光素酶报告基因的技术流程12

发布网友发布时间：2023-11-24 17:55

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热心网友时间：2024-07-14 17:54

（1）用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点。
（2）设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段，将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒（pGL3-basic）中。
（3）筛选阳性克隆，测序。扩增克隆并提纯质粒备用。
（4）扩增转录因子质粒，提纯备用。同时准备相应的空载质粒对照，提纯备用。
（5）培养293（或其它目的细胞），并接种于24孔板中，生长10-24小时（80%汇合度）。
（6）将报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞。
（7）提取蛋白并用于荧光素酶检测。
（8）加入底物，测定荧光素酶的活性。
（9）计算相对荧光强度，并与空载对照比较。

热心网友时间：2024-07-14 17:54

启动子的预测

转录因子的预测

报告基因质粒的构建

实验方法及结果分析

用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点。

设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段，将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒（pGL3-basic）中。

筛选阳性克隆，测序。扩增克隆并提纯质粒备用。

扩增转录因子质粒，提纯备用。同时准备相应的空载质粒对照，提纯备用。

培养293（或其它目的细胞），并接种于24孔板中，生长10-24小时（80%汇合度）。

将报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞。

提取蛋白并用于荧光素酶检测。

加入底物，测定荧光素酶的活性。

计算相对荧光强度，并与空载对照比较。