流式细胞仪-调节荧光补偿是不是把其他颜色荧光都调到零是最好的?
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发布时间:2022-05-04 01:18
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时间:2023-10-21 18:55
荧光补偿是因为每个荧光的光谱都比较宽。用你的例子来说,就是PI的荧光,不仅被PI这个通道的探测器所感应到,而且也同时被FITC的探测器感应到,所以一个PI染色会出现在双染的区域。另外FITC的荧光,也会同时被两个探测器所检测到。这时候就要做compensation.
你做compensation的时候,必须有3个管子,一个是无染料的,一个只染了PI的,另外一个只染了FITC。第一个管子,原来调节FL-1和FL-2的电压,是所有细胞都位于左下象限。然后保持电压不变,上FITC的管子,调节compensation 的数值(FL-2 - FL-1%),使FITC阳性的细胞都位于右下象限,但是在水平位置上和阴性细胞一致,而不是最低。然后再上PI的管子,调节compensation数值,使PI阳性的细胞都位于左上象限。在垂直位置上和阴性细胞一致,但不是最低。
简单的说,就是把单个阳性的染色放到属于原来自己的位置上。
只有这个设置好了,才能往下做实验。
从你的图上看,你四个象限的设置并没有用无染色的细胞来设置。PI的阳性阈值设的很高。参照是什么?FITC的参照阈值是什么?这些都必须用无染色的细胞来设置。追问非常感谢您详细的回答!我的参照都是双染的control组细胞,我是以control组细胞来调,没有设单阳孔;如果我把PI的阈值再调低,那control组的细胞团会更偏下,这个怎么解决?如果以双阴性来调节细胞团的位置的话,一般双染的细胞团会相对双阴性向右偏移。这个是什么原因?所以以双阴性来调节是不是不太恰当?
追答你的基本概念全错了,没有双阴性的,就无法设置阳性的gate。你如何判断那些是染色后的阳性细胞呢。
你说的向右移动,就是你compensation设置有问题,还有gate设置的问题
热心网友
时间:2023-10-21 18:55
荧光补偿是因为每个荧光的光谱都比较宽。用你的例子来说,就是PI的荧光,不仅被PI这个通道的探测器所感应到,而且也同时被FITC的探测器感应到,所以一个PI染色会出现在双染的区域。另外FITC的荧光,也会同时被两个探测器所检测到。这时候就要做compensation.
你做compensation的时候,必须有3个管子,一个是无染料的,一个只染了PI的,另外一个只染了FITC。第一个管子,原来调节FL-1和FL-2的电压,是所有细胞都位于左下象限。然后保持电压不变,上FITC的管子,调节compensation 的数值(FL-2 - FL-1%),使FITC阳性的细胞都位于右下象限,但是在水平位置上和阴性细胞一致,而不是最低。然后再上PI的管子,调节compensation数值,使PI阳性的细胞都位于左上象限。在垂直位置上和阴性细胞一致,但不是最低。
简单的说,就是把单个阳性的染色放到属于原来自己的位置上。
只有这个设置好了,才能往下做实验。
从你的图上看,你四个象限的设置并没有用无染色的细胞来设置。PI的阳性阈值设的很高。参照是什么?FITC的参照阈值是什么?这些都必须用无染色的细胞来设置。追问非常感谢您详细的回答!我的参照都是双染的control组细胞,我是以control组细胞来调,没有设单阳孔;如果我把PI的阈值再调低,那control组的细胞团会更偏下,这个怎么解决?如果以双阴性来调节细胞团的位置的话,一般双染的细胞团会相对双阴性向右偏移。这个是什么原因?所以以双阴性来调节是不是不太恰当?
追答你的基本概念全错了,没有双阴性的,就无法设置阳性的gate。你如何判断那些是染色后的阳性细胞呢。
你说的向右移动,就是你compensation设置有问题,还有gate设置的问题
热心网友
时间:2023-10-21 18:55
荧光补偿是因为每个荧光的光谱都比较宽。用你的例子来说,就是PI的荧光,不仅被PI这个通道的探测器所感应到,而且也同时被FITC的探测器感应到,所以一个PI染色会出现在双染的区域。另外FITC的荧光,也会同时被两个探测器所检测到。这时候就要做compensation.
你做compensation的时候,必须有3个管子,一个是无染料的,一个只染了PI的,另外一个只染了FITC。第一个管子,原来调节FL-1和FL-2的电压,是所有细胞都位于左下象限。然后保持电压不变,上FITC的管子,调节compensation 的数值(FL-2 - FL-1%),使FITC阳性的细胞都位于右下象限,但是在水平位置上和阴性细胞一致,而不是最低。然后再上PI的管子,调节compensation数值,使PI阳性的细胞都位于左上象限。在垂直位置上和阴性细胞一致,但不是最低。
简单的说,就是把单个阳性的染色放到属于原来自己的位置上。
只有这个设置好了,才能往下做实验。
从你的图上看,你四个象限的设置并没有用无染色的细胞来设置。PI的阳性阈值设的很高。参照是什么?FITC的参照阈值是什么?这些都必须用无染色的细胞来设置。追问非常感谢您详细的回答!我的参照都是双染的control组细胞,我是以control组细胞来调,没有设单阳孔;如果我把PI的阈值再调低,那control组的细胞团会更偏下,这个怎么解决?如果以双阴性来调节细胞团的位置的话,一般双染的细胞团会相对双阴性向右偏移。这个是什么原因?所以以双阴性来调节是不是不太恰当?
追答你的基本概念全错了,没有双阴性的,就无法设置阳性的gate。你如何判断那些是染色后的阳性细胞呢。
你说的向右移动,就是你compensation设置有问题,还有gate设置的问题