求助RNA提取

发布网友发布时间：2023-01-12 10:54

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热心网友时间：2023-10-31 22:17

RNA提取步骤及注意事项（仅供参考）：

实验步骤如下：

1.取50—100mg的组织,加入1ml Trizol试剂，用匀浆器打匀(Trizol先放于冰上)。

2.将匀浆室温放置5min。

3.加入200μl氯仿,剧烈震荡混匀30s，冰上静置3min。

4.12000rpm，4℃离心15min。

5.将上清液小心转移到新的1.5ml离心管中（取400μl），加入等量体积的异丙醇，上下颠倒几次混匀，室温下放置15min。（此步中注意：不要吸取任何中间层物质，宁缺勿烂。）

6.12000rpm，4℃离心15min。

7.小心移去上清液，防止RNA沉淀丢失。

8.用70%乙醇（DEPC处理的水配制）洗涤1次，加入700μl乙醇，将RNA沉淀弹起，漂洗。（此时RNA是不溶解的）

9.8000rpm，室温离心10min。

10.尽可能彻底地吸走上清，防止RNA沉淀丢失。

11.真空离心干燥3—5分钟，或放在室温下使乙醇完全挥发掉。

12.沉淀用30μl DEPC-H2O溶解。如发现沉淀难溶，68℃处理10min。

13.RNA检测

(1)测定样品在260nm和280nm的吸光值按1OD=40μg/ml RNA计算RNA的产量。

OD260/OD280在1.8-2.0。

(2)进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳,确定RNA的完整性和污染情况。

注意事项：

1.获得RNA效率低有一下原因

a:样品裂解或匀浆处理不彻底

b:最后得到地RNA沉淀未完全溶解

2.A260/A280＜1.65原因

a:检测吸光度时，RNA样品不是溶于TE，而是溶于水。低离子浓度和低PH条件下，A280值会较高

b:样品匀浆时加地试剂量太少

c:匀浆后样品未在室温放置2分钟

d:水相中混有有机相

e:最后得到地RNA沉淀未完全溶解

3.RNA降解原因

a:组织取出后没有马上处理或冷冻

b:样品或提取地RNA沉淀保存于-5--20度，未在-60--70度保存

c:细胞在胰酶处理时被破坏

d:溶液或离心管未经RBase去处理